丹参中丹酚酸B提取工艺优化及抗氧化活性分析*

朱丹桂 徐正圆 董静怡 张宇燕△

（1.浙江中医药大学附属金华中医院，浙江 金华 321000；2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

丹参为唇形科植物丹参（SalviamiltiorrhizaBge.）的干燥根及其根茎，是传统中药，味苦，性微寒，通过分离与鉴定的化学成分已有百余种，主要包括丹参酮类、丹酚酸类、挥发油类、多糖类、含氮类化合物等［1］。现代药理学研究表明，丹参除具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等传统功效外，还具有抗凝血、抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗肿瘤等拓展功效，其活性成分及丹参制剂具有一定的抗动脉粥样硬化、改善心肌重构、抗心肌缺血、抗心律失常的心血管保护作用，因而被广泛应用于心血管疾病及炎症相关疾病的治疗［1-5］。丹参中主要有效成分有水溶性物质和脂溶性物质两大类，其中丹酚酸B 是丹参的主要水溶性复合物之一，是丹参总酚酸含量最高、活性最强的成分［6］。有研究通过HPLC 法检测大鼠注射丹红注射液后血浆中丹酚酸类成分的含量，显示丹酚酸B 在大鼠血浆中的含量明显高于其他酚酸类［7］，并筛选抗氧化活性成分发现丹酚酸B具较强抗氧化活性［8］。

本研究以丹参主要活性成分丹酚酸B 含量为指标，通过正交试验设计优化不同的提取工艺，并通过R语言分析正交试验得到最优提取方案，同时探讨不同提取工艺下提取液的抗氧化活性，以期为临床应用丹参治疗心脑血管等重大疾病及开发有效的中药新药奠定基础。

1 材 料

丹参药材购于浙江中医药大学中药饮片有限公司，经鉴定均符合《中国药典》药材项下的质量要求；丹酚酸B（PA0418RA）、DPPH（W10A8E33599）：上海源叶生物科技有限公司，HPLC≥98%。VC（TM01162）：上海西陇生化科技有限公司。其余均为分析纯。紫外可见分光光度计：UV-2800，上海恒科仪器有限公司。电子天平：FA2104，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 丹酚酸B含量测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B 对照品3.25 mg，纯水定容至25mL，得130 μg/mL 的对照品溶液。

2.1.2 标准曲线的绘制 分别取2.1.1 节中对照品溶液不同体积，加入5 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，摇匀，得到梯度浓度。在286 nm 处测定吸光度，以吸光度对浓度进行线性回归，得到回归方程y=0.0073x+0.0118，R2=0.9989，线性良好。

2.1.3 精密度试验 取丹酚酸B 对照品，按2.1.2 节的方法平行测定5 次，每次吸取1.5 mL，计算得丹酚酸B吸光度RSD为1.14%。

2.1.4 稳定性试验 取丹酚酸B 对照品，按2.1.2 节的方法在0、2、4、6、8、10 h进行测定，每次吸取1.5 mL，计算得丹酚酸B吸光度RSD为1.12%。

2.1.5 重复性试验 等量精密称取同批次样品5 份，按2.1.2 节的方法测定吸光度，计算丹酚酸B 含量的RSD为6.13%。

2.1.6 加样回收试验 精密称取已知含量的丹参粉末0.3 g，分别精密吸取2.1.1 节中对照品储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，按照2.1.1 节制备样品液并测定含量，计算得平均回收率为93.01%。

2.2 丹酚酸B提取单因素实验

2.2.1 提取时间 称取10 g 丹参，控制料液比为1∶12，加热回流，在2 h 内每隔5 min 取一次样，并测定其吸光度值。结果如图1 所示，表明随着时间增长，丹酚酸B 的浓度在逐渐升高，其中在1.5 h 处的样品增长趋势很快。为节约工业成本，减少人力物力的消耗，优选1.5 h。

图1 提取时间、提取次数、料液比对丹酚酸B提取的影响

2.2.2 提取次数 称取丹参10 g，控制料液比为1∶12，加热回流提取1 h，过滤，收集滤液，浓缩定容至50 mL，取出少量样品待测；往滤渣中继续加入12 倍体积的蒸馏水，加热回流1 h，过滤，合并两次滤液，定容至100 mL，取出少量样品待测。再如上操作3次，每次收集滤液并取出少量样品待测。紫外测定5 份溶液的吸光度值并计算浓度。结果如图1 所示，随提取次数的增加，丹酚酸B 的浓度不断增高，但是在提取3 次之后增长趋势变缓。根据节约成本的要求，煎煮3 次更符合工业产业化。

2.2.3 料液比 称取10 g丹参，料液比分别为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 加热回流提取1 h，收集滤液并定容测定吸光度，计算丹酚酸B 浓度。结果如图1 所示，丹酚酸B浓度随料液比增加呈波折上升趋势，在料液比达1∶12 后丹酚酸B 浓度增加趋势不大，且有下降趋势，因此，12倍加水量体积较优。

2.3 正交试验优化

在单因素考察的基础上进一步采用正交试验优化丹参提取工艺，选取提取时间（A）、提取次数（B）、料液比（C）、误差（D）作为考察因素，每个因素各取3 个水平，进行L9（34）正交试验，筛选最佳工艺条件，因素水平见表1，结果如表2所示。

表1 正交因素水平设计

表2 正交试验结果

2.4 结合数学模型分析正交试验

2.4.1 R 语言环境进行BP 神经网络建模 在R 语言数据环境下建立3层结构（只有1个隐层）的BP神经网络模型，输入层节点数设为4，分别为煎煮时间、煎煮次数、加水量倍数及误差；输出节点数为1，即提取液中丹酚酸B 的提取率。将正交试验的9 组数据分别采用留一法进行交叉验证，相关参数设置：初始随机权（rang）=0.6，参数重量衰变（decay）=5×10-5，最大迭代次数（maxit）=900，其他参数设置为默认值。在此参数条件下对BP神经网络进行留一法交叉训练，以平均预测误差和平均拟合误差作为选取隐层神经元（size）的依据标准。

结果如表3 所示，隐层神经元为1 时，平均预测误差、平均拟合误差均小于5%，具统计学意义；而隐层神经元为0、2、3 时，平均预测误差和平均拟合误差未完全符合筛选条件（即小于5%），故排除。且隐层神经元数增加到一定数目（最高为8）时，可能会产生拟合过度的现象。因此在上述参数的条件下，以正交试验的9 组数据为样本，对不同的隐层神经元进行拟合误差的训练，结果如表4 所示，随隐层神经元个数增加，拟合误差呈先升高再降低的趋势，由此可判断隐层神经元为1 之后，增加隐层神经元数将导致网络模型的拟合过度。因此，此次模型的隐层神经元设定为1，此时BP神经网络稳定可靠。

表3 隐层神经元（size）训练结果（%）

表4 隐层神经元（size）训练结果

2.4.2 R 语言环境中应用遗传算法进行目标优化 遗传算法是一种基于基因遗传学原理与自然界优胜劣汰的进化规律的优化搜索方法，可以达到全面系统地优化搜索，避免数学公式复杂的推导过程以及参数选择过程。根据遗传算法的基本思想，采用R 语言的代码进行一系列编程，整合实数编码方法，在种群数大小为900、接近的最大代数为100 代、最大不可变代数为10 代时，能够得到最优解，收敛公差是1×10-3，其他参数均为默认值。由遗传算法得到的结果是运行时间为2 s，运行到第12代时找到丹参最佳提取工艺条件为提取1.5 h，提取3次，料液比为1∶8，此条件下得到的丹酚酸B最优提取率为95.22 mg/g。

2.5 最优工艺验证

分别称取等量丹参样品5 份，按照最佳工艺条件进行提取，紫外测定吸光度并计算含量。结果如表5所示，相对误差为4.45%，说明优化后实验测量值和网络预测值较吻合，说明该数学模型稳定性良好，具有较好的网络预测性。

表5 最佳工艺验证结果

2.6 DPPH法测定体外抗氧化能力

将正交试验中的9 组样品稀释至适当浓度，在96孔板中加入100 μL 样品溶液和100 μL DPPH 溶液（100 μg/mL），避光反应30 min 后在517 nm 波长下测定吸光度值，以Vc作为阳性对照。清除率按下式进行计算。。（其中A0为DPPH+甲醇，A1为待测液+DPPH，A2为待测液+甲醇）

结果如图2 所示，第7 组和第5 组的抗氧化能力较好，而第2 组的抗氧化能力较差。进一步进行方差分析后（如表6）发现，C因素即料液比对提取液的抗氧化影响较大，而A、B因素对提取液的抗氧化影响不大，考虑到药材、时间的综合利用，最佳提取条件应为A1B1C3，即提取1 h，提取1 次，料液比1∶12，此条件下的提取液抗氧化作用强。

表6 丹酚酸B方差分析表

图2 不同提取液DPPH自由基清除率

3 讨 论

丹参是临床常用药材之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等药理作用，丹参及其制剂常用于配伍其他药物治疗多种疾病［9］。现有研究通过网络药理学方法的构建，发现丹参中的水溶性成分如丹酚酸B 可通过多靶点、多途径发挥抗动脉粥样硬化的作用［10］。同时，大量研究表明丹参在多方面表现出较强的抗氧化活性，这可能就是丹参在治疗活性氧诱发的心脑血管疾病方面有显著效果的原因之一［11］。经研究发现，丹红注射液可以有效减轻氧自由基对脑组织细胞的损害，通过HPLC法发现含量最多的4种成分主要来自丹参，其中包含丹酚酸B，表明丹酚酸B 可能在此发挥了很大的作用［12-13］。

丹参主要有水溶性和脂溶性成分，其提取方法一般有水提法［14］、醇提法［15］、超声提取法［16］等。本研究以水溶性成分丹酚酸B 为指标，故采用加热回流水提法，在单因素实验的前提下，分析并确定正交分析表的因素和水平，按L9（34）正交试验表条件提取，得到的结果应为较优解。但正交设计仅考虑三因素的四水平对药物提取工艺的影响，所得出来的数据仅为较优解，而不是最优解；而R语言具有强大的数学统计能力，可以充分分析模块来实现数据的可视化，且操作简便，可以对各种数据进行处理，故本实验带入正交提取实验的9组数据来进行R 语言分析；R 语言可以从整个实验区间进行考虑，分析得出最优解。本研究在利用数学模型来减少人力物力的同时还可以充分发掘丹参的最优提取组合，以期充分利用中药资源。

本研究通过DPPH 法将正交试验得到的提取液进行抗氧化实验。DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，和乙醇混合后呈深紫色，在可见光区的吸收光波长为515 nm，当DPPH 溶液与自由基清除剂（本实验为提取液）混合后时，吸收会减弱甚至消失［17］，因此可用来检测自由基的清除情况评价某种物质的抗氧化作用能力。通过DPPH 实验发现，丹参提取液具有良好的体外抗氧化能力，结合方差分析处理后显示C 因素即液料比具有显著差异，而其他两个因素水平不具有显著差异，但总体而言，不同提取工艺的提取液的体外抗氧化能力差异较大，需要更深的研究探讨。

本实验建立丹酚酸B 的含量测定方法，并利用R语言结合BP神经网络进行分析，求得最优的丹参提取工艺，此最佳提取工艺的条件为：提取时间1.5 h，提取3 次，料液比1∶8，其丹酚酸B 提取率的网络预测值为95.22 mg/g，具有良好的预测性。最优提取工艺的确定可为临床充分利用丹参中药材资源提供基础，为工业生产提供建议，为制剂工艺条件优化提供参考。不同工艺的活性不同也为临床应用提供了科学依据，有助于指导临床使用和中药新药开发。