中医药治疗扩张型心肌病用药规律及作用机制*

贾倩芳,李习婉,岳志霞

新乡医学院第一附属医院,河南 新乡 453100

扩张型心肌病(dilated cardiomypoathy,DCM)是以左心室或双心室扩张并伴有心功能损伤或减退的一种常见心肌疾病[1],主要表现为难治性心衰、恶性心律失常、心源性休克甚至猝死等[2],其发病率呈逐年上升趋势,2015年的一项研究显示,全球心肌病10年内患病率增加了27%[3]。DCM发病机制较为复杂,目前临床尚缺乏有效特异的治疗手段,预后较差[4]。DCM可归属于中医“心衰”“心胀”等范畴,气虚血瘀水停是导致扩张型心肌病的重要病机[5]。传统中药复方具有多成分、多靶点、副作用小等优点,可通过抑制心肌细胞凋亡、心肌纤维化,改善心室重塑,改善心功能,在DCM治疗中疗效确切[6]。本文通过数据挖掘治疗DCM的方药,统计分析其中高频药物及核心组合,并利用网络药理学方法分析其治疗DCM的作用机制及相关靶点通路,以期为DCM的临床治疗提供经验总结,为中医药治疗DCM提供理论及数据支撑。

1 资料与方法

1.1 处方来源以“中药”“扩张型心肌病”为检索词,对中国知网、万方医学网、维普数据库等进行搜索,时间范围从开库至2021年6月。

1.2 文献纳入与排除标准纳入标准:(1)临床诊断明确;(2)以内服中药为主要治疗方法;(3)组方用药完整;(4)包括名老中医验案、随机对照试验。排除标准:(1)细胞、动物等基础实验类研究;(2)综述、理论研究类文献;(3)有方剂名称,无药物组成;(4)重复文献及非复方文献;(5)患者合并其他严重脏器疾病。

1.3 中药名称规范参照全国中医药高等教育“十二五”规划教材《中药学》规范中药名称,例如生晒参、白参统一为人参;云茯苓统一为茯苓;坤草统一为益母草等。

1.4 数据分析将筛选出的中药处方录入中医传承计算平台V3.0。数据录入完成后由双人对数据进行核对,以确保数据的准确及完整。首先对药物进行频次统计;其次,将支持度个数设置为30,置信度设置为0.9,进行组方规律分析;最后,设置相关度为8,惩罚度为2进行聚类分析,提取组合后导出新处方,挖掘中医药治疗扩张型心肌病的核心药物配伍。

1.5 核心药物活性成分及靶点预测将核心中药输入中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP),通过口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18筛选并建立核心中药化学成分数据库。在TCMSP、Pubchem、Swiss Target Prediction等数据库获取药物活性成分作用靶点,并做去重处理,建立药物化学成分相关靶点蛋白数据库。

1.6 DCM相关靶点及核心药物治疗DCM潜在靶点的预测以“dilated cardiomyopathy”为检索词,登录Genecard数据库[7]、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM)、Drugbank 数据库、治疗靶点数据库(therapeutic target database,TTD)[8]查找DCM的相关靶点,合并以上疾病数据库靶点后,删除重复值,得到最终DCM靶点。取药物化学成分相关靶点及疾病靶点的交集得出共有靶点,即为核心药物治疗DCM潜在靶点。

1.7 PPI网络及“核心药物-有效成分-作用靶点”网络的构建打开STRING网站,导入潜在靶点,设置置信度>0.7,获取PPI网络,保存为CSV文件。利用Cytoscape 3.7.2软件的NetworkAnalyzer及自带插件CytoNCA进行拓扑分析,得到核心靶点基因,同时构建“核心药物-有效成分-作用靶点”网络图。

1.8 潜在靶点富集分析使用 R语言对核心药物治疗DCM的核心靶点进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集富集,并对富集结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 用药频次分析以“中药”“扩张型心肌病”为检索词,对中国知网、万方医学网、维普数据库等进行检索,共检索出1 243篇,去除重复文献后严格按照文献纳入与排除标准纳入文献 370篇,筛选得到处方 205首,包含296味中药,通过“频次统计”,得到治疗DCM频次最高的中药为黄芪。使用频次≥20次的药物有30味,见表1。

表1 治疗扩张型心肌病中药处方中使用频次≥20次的中药

2.2 药物性味分析对296味中药进行四气、五味、归经分析得出,温性药使用最多,频次为909;甘味药物使用最多,频次为1 440;归经位于前3位的依次是肺经、心经、脾经,频次分别为1 240、1 144、1 074。见表2—表3。

表2 处方中药物四气、五味频次分布表

表3 处方中药物归经的频次分布表

2.3 基于关联规则的组方规律分析将支持度设置为40,置信度设置为0.75,点击“药物模式”,得到药物组合36个,包含中药12味,按出现频率由高到低排序,见表4。点击中医传承计算平台中“规则分析”,得到22条药物组合规则,当药物后出现“->”时,代表右侧药物在左侧药物组合出现的概率,药物规则分析见表5。点击“网络展示”功能,得到12味中药的网络展示图,见图1。

图1 治疗扩张型心肌病药物组合网络展示图

表4 处方中出现频次≥40次的中药组合

表5 关联规则分析得到(置信度≥0.75)的药物组合

2.4 高频中药系统聚类分析在中医传承计算平台聚类分析中,通过K均值算法,将K值设置为6,点击提取组合,聚类生成5个高频中药组合,见表6,其中,核心组合4中黄芪、茯苓、丹参、桂枝为中药频数统计中排名最前的四味中药,且与扩张型心肌病温阳益气、活血利水[9]治法高度契合,因此将此四味中药作为核心中药配伍进行网络药理学探讨。

表6 治疗扩张型心肌病核心药物组合

2.5 药物活性成分及靶点筛选在TCMSP数据库中,通过OB≥30%、DL≥0.18筛选得到黄芪、茯苓、丹参、桂枝有效成分分别24个、15个、65个、7个,删除无靶点成分,分别得出黄芪、茯苓、丹参、桂枝有效成分21个、6个、57个、6个,共计92个。见表7。基于TCMSP、Pubchem、Swiss Target Prediction等数据库得到药物活性成分作用靶点1 486个,去除重复值后得到261个靶点,构建核心药物活性成分数据库。

表7 核心药物部分活性成分信息表

2.6 DCM疾病靶点及核心药物治疗DCM的潜在靶点以“dilated cardiomyopathy”为关键词,从Genecard、OMIM、Drugbank、TTD等数据库获取并筛选得到DCM相关靶点1011 个。使用 Venny 2.1 在线工具,将核心药物相关靶点与DCM靶点进行映射,获得核心药物治疗DCM潜在作用靶点161个。见图2。

图2 核心药物靶点与疾病靶点韦恩图

2.7 PPI网络通过STRING数据库构建潜在靶点PPI网络关系,将TSV文件导入至Cytoscape软件进行可视化,得到PPI网络图,该网络得到361个节点和3 391条边,如图3。拓扑分析得到该网络的中介中心度(betweenness centrality,BC)、接近中心度(closeness centrality,CC)、度值(degree)、基于局部平均连接度的方法(local average connectivity-based method,LAC)的中位数分别是0.004 21、0.603 774、61、40.705 88,以大于BC、CC、degree、LAC中位数为条件进行筛选得到节点30个,按Degree值排序,分别为AKT1、TNF、TP53、VEGFA、IL-6、CASP3、IL1B、EGFR、JUN、SRC、STAT3、ESR1、MMP9、MYC、HIF1A、PTGS2、PPARG、FOS、HSP90AA1、PTEN、NOS3、CCND1、CXCL8、ERBB2、CCL2、MMP2、MAPK8、BCL2L1、HMOX1、RELA,如图4,其中Degree值越大,成为核心基因的概率越大。将中药、成分、靶点导入到Cytoscape软件构建“核心药物-有效成分-作用靶点”网络,如图5所示,并通过Cytoscape分析得出,编号为MOL000098、MOL00042、MOL000006、MOL000378、MOL007154、MOL007145的成分度值最大,为治疗DCM的潜在活性成分,分别是槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、7-0-甲基异粘核醇、丹参酮等。

图3 PPI网络图

图4 核心靶点筛选

图5 “核心药物-有效成分-作用靶点”网络

2.8 富集分析GO富集分析得到3055个条目,包括生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、细胞组分(cellular component,CC)[10],其中BP 2 731条,CC 113条,MF 211条,分别取BP、CC、MF排名前10位的条目进行可视化分析(q<0.05),如图6。分子功能主要涉及DNA结合转录因子(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription)、细胞因子受体结合(factor binding)、泛素样蛋白连接酶结合(cytokine receptor binding)、整合素结合(ubiquitin-like protein ligase binding)、儿茶酚胺结合(integrin binding)等;生物过程主要涉及伤口愈合(wound healing)、细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)、循环系统中的血管过程(vascular process in circulatory system)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、血管直径调节(regulation of tube diameter)、体液水平的调节(regulation of body fluid levels)等;细胞组成主要涉及质膜外侧(external side of plasma membrane)、顶端质膜(apical plasma membrane)、突触膜(synaptic membrane)、内吞囊泡(endocytic vesicle)、转录调节复合物(transcription regulator complex)、髓磷脂鞘(myelin sheath)等。

图6 GO富集分析图

KEGG富集分析得到187个条目,根据q值,取排名前30位的条目作图,如图7所示,主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌症中的途径(Pathways in cancer)、脂质与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、乙型肝炎(Hepatitis B)、内分泌抵抗(Endocrine resistance)、癌症中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、人巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)等。

图7 KEGG信号通路图

3 讨论

DCM发病机制目前尚未明确,现代医学认为其发病机制包括遗传因素、病毒持续感染、自身免疫反应等[11],心室重塑是其重要的病理变化,也是诸多严重并发症的重要原因之一[12],常规治疗主要包括血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(angiotensin receptor-neprilysin inhibitor,ARNI)、β受体阻滞剂、醛固酮拮抗剂、利尿剂等,预后仍然较差,心脏移植为该类患者提供了较大的生存机会,但受费用、供体、排异的限制,并不能使更多患者获益。临床应用传统中药联合西药治疗能减轻副作用,提高临床疗效。

《血证论》记载“血积既久,其水乃成”“水病累血,血病累气”,说明气虚、血瘀是DCM的发病基础,水停为病变结果,由此可知,DCM病机属本虚标实,初期以气虚为本,血瘀为标,后期常累及心肾之阳,而导致脏腑功能失调[13]。本病以气虚阳虚为本,痰湿、血瘀、水停为标,根据其临床表现将其归属于“心衰”“喘证”“水肿”“心悸”“心胀”等范畴。中医药治疗DCM通过辨证论治,多靶点、多途径调节患者机体,应用益气、温阳、活血、利水方药疗效显著[14]。

本研究共筛选出205条处方,包含中药296味,其中频次≥20次的中药共30味,分别为:补益类中药有黄芪、麦冬、五味子、党参、白术、人参、附子、大枣、白芍;活血化瘀类中药有丹参、川芎、红花、赤芍、益母草、桃仁;利水渗湿中药有茯苓、葶苈子、猪苓、车前草。根据以上药物的功能主治,可知DCM的病机特点为:虚、瘀、水,因此治疗DCM时多应用益气温阳、活血化瘀利水之法。对药物基本信息分析可知DCM用药多为甘温、苦寒为主,提示DCM病机复杂,且多兼夹病证。通过关联规则分析可知,“黄芪、茯苓”“黄芪、丹参”“黄芪、桂枝”“茯苓、丹参”“茯苓、桂枝”为出现频次最高的药对,通过聚类分析得出治疗DCM核心药物组合6组,其中核心处方1“茯苓、陈皮、黄芪、半夏、丹参、白术、党参、葶苈子”功擅利水渗湿,其中茯苓、陈皮、葶苈子健脾祛湿利水,黄芪、白术、党参益气,半夏燥湿化痰;核心处方2“桂枝、黄芪、附子、丹参、茯苓、葶苈子、党参、炙甘草”具有温阳益气、活血化瘀之功;核心处方3“黄芪、丹参、丹皮、当归、茯苓、党参、赤芍、川芎”主要作用为益气活血;核心处方4“黄芪、茯苓、丹参、桂枝、红花、泽泻、白术、猪苓”功擅益气温阳、活血利水;核心处方5“黄芪、丹参、五味子、茯苓、麦冬、桂枝、人参、川芎”主要功效为益气养阴活血,可看作是生脉散加减,《内外伤寒惑感》中记载“人参之甘补气,麦冬苦寒泄热,补水之源,五味子之酸肃清燥金,名曰生脉散”,为著名的补气养阴方剂,人参功擅大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血,对于气阴两虚、脉微欲绝等危重证候疗效较好。其中“黄芪、茯苓、丹参、桂枝”为用药频次最高的中药,黄芪益气升提,茯苓健脾祛湿,丹参活血化瘀/桂枝温阳通脉,四者共奏益气温阳、活血利水之功,与DCM基本病机相吻合,因此作为核心药物组合进一步分析。

因此,以“黄芪、茯苓、丹参、桂枝”作为研究对象,通过TCMSP、Genecard、string等数据库分析该核心药物组合治疗DCM的潜在作用机制。分析得到核心药物治疗DCM可能的主要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、丹参酮Ⅱa。研究表明,槲皮素能抑制心肌细胞中的TGF-β1、Smad3、CollagenI表达水平,降低心室舒张和收缩时间,提高射血分数,减轻心肌细胞损伤,保护心功能[15-16]。β-谷甾醇可通过线粒体呼吸产生活性氧增强细胞谷胱甘肽氧化循环以保护心脏免受氧化应激反应[17]。木犀草素作为丹参的主要成分,可拮抗血管紧张素Ⅱ刺激纤维细胞增殖,起到保护心脏的作用[18]。丹参酮Ⅱa可通过降低心肌纤维化水平,抑制心室重塑,以缓解心衰患者症状,改善心功能[19-20]。

核心药对与疾病共同靶点162个,通过PPI网络构建及Cytoscape软件筛选得到核心靶点30个,根据度值,关联度较大的靶点有蛋白激酶B(protein kinase B1,AKT1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、TP53、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、CASP8等。心肌细胞有高密度的线粒体分布和独特的线粒体动力学特征,代谢重构可直接或间接影响心肌重构的进展[21-22]。研究发现,黄芪可通过调节能量代谢治疗DCM,如黄芪皂苷Ⅳ可改善心肌能量代谢抑制大鼠心室重塑[23],抑制心肌纤维化及心肌细胞凋亡[24-25],通过AKT1、P13K信号通路减轻炎症反应[26]。熊竹素作为黄酮类化合物,可通过NOX4/ROS/NF-κB通路抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖,抑制氧化应激,是血管重构性疾病的重要靶点[27]。

富集分析结果显示,“黄芪、茯苓、丹参、桂枝”通过多通路发挥作用,主要包括心血管系统、炎症过程和免疫抑制。HIF-1信号通路通过上调血管系统相关蛋白基因表达,恢复血流,降低缺血损伤[28]。PI3K-AKT信号通路是控制心肌细胞存活和功能的重要促增殖及抗凋亡信号通路之一[29],在细胞凋亡、能量代谢等方面发挥重要作用。cAMP信号通路是经典的G蛋白偶联受体介导的信号通路,参与调解多种细胞活动,是离子转运的重要通路,可磷酸化L型钙通道发挥调节心率的作用[30]。研究证实,cAMP信号通路与抑郁的发生密切相关[31-32]。此外,TNF、HIF-1、IL-17、MAPK信号通路均参与心肌纤维化、心室重塑的病理过程,其中IL-17作为一种促炎性细胞因子,可加速氧化应激和细胞凋亡[33];MAPK信号通路参与炎症反应[34],还可干预动脉粥样硬化,调控血小板功能[35]。以上结果体现了“黄芪-丹参-茯苓-桂枝” 核心药物组合通过多成分、多靶点、多通路治疗DCM。

综上,本文通过数据挖掘治疗DCM的中药处方,总结用药规律,并运用网络药理学技术对“黄芪-丹参-茯苓-桂枝”核心组合进行分析,初步研究其可能的靶点、通路及作用机制,为中医辨证治疗DCM提供值得借鉴的组方思路及数据支撑。