血清miR-144、miR-203 对胃癌根治术患者预后的评估

王光尧， 李凤东

（1. 南京医科大学附属常州第二人民医院胃肠外科，常州 213000； 2.南京医科大学附属常州第二人民医院消化内科，常州 213000）

胃癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，2018 年全球新发癌症病例1 810 万例，其中胃癌占比8.2%，我国新发45.6 万例，死亡39.0 万例[1]。基于根治性手术的多学科治疗成为胃癌的首选治疗手段，尤其对于早期患者来说，是目前可能治愈的有效手段，但术后仍存在较高的局部复发和远处转移概率，5 年累积存活率仅为30%～50%[2]，因此，早期评估胃癌根治术后预后具有重要意义。研究[3]表明，肿瘤发生及发展过程中存在多种非编码基因和编码基因异常表达，微小RNA（microRNA，miR）是一种非编码小分子RNA，因其具有促癌或抑癌作用而被广泛关注。近年来，有研究[4-5]显示，miR-144、miR-203 在多种实体肿瘤组织中表达下调，参与肿瘤细胞增殖、浸润、转移、耐药等行为。也有研究[6-7]报道，胃癌组织中miR-144、miR-203 表达明显下调，可作为胃癌诊断和预后评估的生物学标记物。但血清miR-144、miR-203 是否可预测胃癌根治术后预后有待研究，本研究旨在分析血清miR-144、miR-203水平对胃癌根治术后预后的评估价值，以期为临床早期评估患者预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取南京医科大学附属常州第二人民医院（2015 年1 月至2017 年12 月）收治的113 例接受胃癌根治术治疗的胃癌患者为胃癌组，其中男性74 例，女性39 例；年龄34～76 岁，平均年龄（50.02±8.61）岁；肿瘤直径：53 例≥5 cm，60例＜5 cm；TNM 分期[8]：32 例Ⅰ期，38 例Ⅱ期，43 例Ⅲ期；分化程度：21 例低分化，33 例中分化，59 例高分化；52 例淋巴结转移。纳入标准：1）经术后病理确诊；2）TNM 分期为Ⅰ～Ⅲ期，具备胃癌根治术治疗指征[9]；3）患者及家属均知情；4）临床资料完整，可接受随访者；5）初次确诊，未接受任何抗肿瘤治疗者；6）年龄＜80 岁。排除标准：1）合并其他部位肿瘤者；2）既往恶性肿瘤病史者；3）远处转移者；4）心、肝、肾功能严重受损者。另选取同期66 例接受内镜下切除治疗的胃息肉患者为对照组，其中男性43 例，女性23 例；年龄38～74岁，平均年龄（51.28±8.55）岁。两组性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。本研究经常州第二人民医院伦理委员会审核批准（2021伦字128 号）。

1.2 方法

采集两组患者入院当日静脉血，3 000 r·min-1离心10 min，半径10 cm，取上清液置于-80 ℃低温冰箱中保存，Total RNA 提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司；货号：RN0401）提取血清总RNA，取5 μL 总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测完整性，Qiagen 逆转录试剂盒（上海易汇生物科技有限公司；货号：206143）合成cDNA，加入上下游引物0.8 μL。miR-144 上游引物：5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，下游引物：5’- TGCTTATACAGTATA GATG-3’；miR-203 上游引物：5’-TCCGATGATCACCAGGAT-3’，下游引物：5’-GTGCAG GGTGCAAGGTAGC-3’；以U6 做内参校正，上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’；上游引物：5’-TCTCGCTTCGGCAGCACA-3’。下游引物：5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’；应用实时荧光定量PCR 测定，反应条件95 ℃、30 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、45 s，循环40 次，2-ΔΔCt法计算血清miR-144、miR-203 相对表达水平。

1.3 预后评估

所有胃癌患者均接受胃癌根治术治疗，其中48 例全胃切除术，65 例远端胃癌根治切除术，术后根据SOX 或FOLFOX 方案辅助化疗。随访3年，截至2020 年12 月，统计3 年累积存活率，定义为手术至随访截止或死亡。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验；正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；Kaplan-Meier曲线绘制存活率，组间存活率Log-rank 检验；多因素Cox 回归分析胃癌根治术预后不良影响因素；ROC 曲线判断血清miR-144、miR-203 水平对胃癌根治术预后不良的评估价值，曲线下面积（area under curve，AUC）采用Z 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清miR-144、miR-203 水平比较

胃癌组血清miR-144、miR-203 水平分别为（0.221±0.070）、（0.343±0.063），对照组分别为（0.964±0.168）、（1.027±0.179），胃癌组血清miR-144、miR-203 水平低于对照组（t=-41.315、-36.941，P均＜0.001）。

2.2 不同临床特征miR-144、miR-203 表达水平

不同性别、年龄、肿瘤直径胃癌患者血清miR-144、miR-203 水平比较，差异无统计学意义（P 均＞0.05），与TNM 分期、分化程度、淋巴结转移差异有统计学意义（P 均＜0.05），见表1。

表1 不同临床特征miR-144、miR-203 表达水平（±s）

表1 不同临床特征miR-144、miR-203 表达水平（±s）

临床特征nmiR-144t 值P 值miR-203t 值P 值性别男性740.214±0.066-1.4420.1520.342±0.064-0.3920.696女性390.234±0.0770.356±0.063年龄≥60 岁630.214±0.070-1.1270.2620.342±0.066-0.2110.833＜60 岁500.229±0.0710.345±0.060肿瘤直径≥5 cm530.208±0.066-1.8650.0650.332±0.067-1.7410.084＜5 cm600.233±0.0720.353±0.058 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期700.236±0.0653.4070.0010.358±0.0623.743＜0.001Ⅲ期430.190±0.0710.313±0.060分化程度高分化590.234±0.0732.0340.0440.356±0.0592.3440.021中低分化540.207±0.0650.329±0.065淋巴结转移有520.199±0.065-3.2680.0010.319±0.061-3.916＜0.001无610.240±0.0690.363±0.058

2.3 血清miR-144、miR-203 水平与胃癌根治术后3 年累积存活率的关系

随访5～36（24.55±7.24）个月，死亡29 例，3年累积存活率为74.34%（84/113）。根据血清miR-144、miR-203 水平均值分为高、低水平组。高血清miR-144 水平组（≥0.221，n=55）死亡9例，3 年累积存活率为83.64%（46/55）；低血清miR-144 水平组（＜0.221，n=58）死亡20 例，3 年累积存活率为65.52%（38/58）。高血清miR-203水平组（≥0.343，n=56）死亡7 例，3 年累积存活率为87.50%（49/56）；低血清miR-203 水平组（＜0.343，n=57） 死亡22 例，3 年累积存活率为61.40%（35/57）。Kaplan-Meier 生存曲线显示，高血清miR-144、miR-203 水平组胃癌根治术后3年累积存活率高于低水平组（Log-rank χ2=7.795、10.083，P=0.005、0.001），见图1。

图1 不同血清miR-144、miR-203 水平与胃癌根治术后3 年累积存活率曲线

2.4 胃癌根治术预后不良影响因素的Cox 回归分析

以性别（男性=1，女性=0）、年龄（≥60 岁=1，＜60 岁=0）、TNM 分期（Ⅲ期=1，Ⅱ期=0）、分化程度（高分化=1，中低分化=0）、淋巴结转移（有=1，无=0）、miR-144、miR-203 为自变量，生存时间为时间变量，预后情况（死亡=1，存活=0）为因变量，建立多因素Cox 回归模型，选择Enter 法筛选自变量。结果显示，TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移为胃癌根治术预后不良独立风险因素，高miR-144、miR-203 为独立保护因素（P＜0.05），见表2、表3。

表2 胃癌根治术预后不良影响因素的单因素Cox 回归分析

表3 胃癌根治术预后不良影响因素的多因素Cox 回归分析

2.5 血清miR-144、miR-203 水平对胃癌根治术预后不良的评估价值

ROC 曲线结果显示，miR-144+miR-203 评估胃癌根治术预后不良的AUC 大于miR-144、miR-203 评估（Z=2.628、2.435，P=0.009、0.015），见表4、图2。

图2 血清miR-144、miR-203 水平评估胃癌根治术预后不良的ROC 曲线

表4 血清miR-144、miR-203 水平对胃癌根治术预后不良的评估价值

3 讨论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发生率居全球首位[1]，尽管其根治性手术的多学科治疗已取得了极大进展，可根据患者的一般情况、体能状态、病理特征等选择化疗方案，但胃癌具有高度异质性，容易产生多药耐药性，导致复发和转移，严重降低了患者的预后存活率。因此，迫切需要发现可早期预测胃癌根治术不良预后的临床标记物。癌症的发生发展是多因素、多机制、多基因共同参与的复杂过程。在人类基因组中，约98%的基因序列被转录为非编码RNA，无须翻译为蛋白，在RNA 水平就可行使各自的生物学功能。miRNA 是一类内源性非编码长19～25 个核苷酸的小RNA，高度保守，可通过结合靶基因调节基因表达，降解mRNA 或阻碍其翻译，进而在转录水平上调控蛋白质表达[10]。研究表明，miRNA多位于肿瘤相关的脆性位点或基因区域，可通过调控肿瘤细胞增殖、凋亡、分化等生物学行为，影响肿瘤发展和易感性[11]。

miR-144 为红细胞发育过程中特异性高表达的miRNA 分子之一，参与红细胞表型转变，因此，既往多用于分析红细胞潜能，近年来大量研究发现，miR-144 还参与了多种恶性肿瘤进展，多呈现低表达状态[12-13]。Cheng 等[12]研究显示，结直肠癌中miR-144 表达明显减少，高表达miR-144 可通过调节白血病前转录因子3 抑制结直肠癌细胞迁移和入侵。Tao 等[13]研究显示，宫颈癌中miR-144 表达明显下调，高表达miR-144 可通过调节血管内皮生长因子A 和血管内皮生长因子C 抑制宫颈癌细胞生长和转移。本研究结果显示，胃癌患者血清miR-144 水平明显低于对照组，与TNM 分期、分化程度、淋巴结转移有关，符合miR-144 在胃癌组织中的表达情况[6]，并提示低血清miR-144 水平参与了胃癌TNM 分期、分化程度、淋巴结转移变化，但其与胃癌根治术不良预后的关系尚不明确。本研究进一步分析显示，高血清miR-144 水平3 年累积存活率明显提升，为预后不良独立保护因素，说明miR-144 可能成为评估预后的生物标记物。关于miR-144 在胃癌中的抑癌机制尚不明确，肿瘤细胞的生长和增殖高度依赖糖酵解获取能量，谭业儒等[14]将miR-144 模拟物转染至胃癌细胞，荧光素酶报告系统鉴定表明，miR-144 可通过靶向抑制糖酵解和凋亡调控子抑制胃癌细胞增殖，诱导其凋亡、自噬。激活增强子结合蛋白4 具有促进胃癌迁移和侵袭的作用，Mushtaq 等[15]将miR-144 模拟物转染至HGC-27 细胞，荧光素酶报告系统鉴定表明，miR-144 能结合其3’非翻译区抑制激活增强子结合蛋白4 表达，进而抑制胃癌迁移和侵袭能力。上述研究表明，miR-144 可靶向抑制糖酵解和凋亡调控子激活增强子结合蛋白4，抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡，进而发挥抑癌作用。

miR-203 基因位于人染色体14q32.33，目前发现的12%的miRNA 基因位于14 号染色体，其中miRNA 密度较高，而该区域又是染色体不稳定的脆性区域，因此，容易出现杂合性丢失，导致肿瘤发生[16]。由于恶性肿瘤组织起源、所处微环境、发生发展信号转导通路不同，所参与的基因也存在差异，miR-203 就是一种在不同肿瘤中表达矛盾的miRNA。王媛等[17]研究显示，子宫内膜癌患者血清miR-203 表达显著提升，与组织学类型和生存时间相关；Huang 等[18]研究显示，非小细胞肺癌中miR-203 表达明显下调，可通过抑制SMAD3抑制非小细胞肺癌细胞迁移和入侵，说明miR-203 在不同恶性肿瘤中具有癌基因或抑癌基因作用。本研究结果显示，胃癌患者血清miR-203水平明显低于对照组，与TNM 分期、分化程度、淋巴结转移有关，提示miR-203 在胃癌中具有抑癌基因作用，符合既往研究报道[7]。进一步分析显示，高血清miR-203 水平3 年累积存活率明显提升，为预后不良独立保护因素，说明血清miR-203 可能成为评估预后的生物标记物。膜联蛋白A4 为多基因家族钙调节磷脂结合蛋白，能促进上皮向间质细胞的转化，进而促进肿瘤组织侵袭和转移，参与胃癌发生发展[19]。Li 等[20]研究发现，胃癌组织和细胞系中miR-203 表达降低与膜联蛋白A4 升高有关，生物信息学分析预测膜联蛋白A4 为miR-203 潜在靶基因，进一步荧光素酶报告基因测定证实二者关系，miR-203 模拟物转染表明miR-203 可靶向抑制膜联蛋白A4 抑制胃癌细胞增殖和上皮-间质细胞转化，抑制胃癌细胞侵袭和转移，发挥抑癌作用。ROC 曲线显示，血清miR-144、miR-203 水平均对胃癌根治术不良预后具有较好的预测价值，AUC 均＞0.80，且联合评估AUC 明显提升，说明联合检测血清miR-144、miR-203 水平能更好地评估胃癌根治术的不良预后，指导为患者制订方案。

综上所述，胃癌患者血清miR-144、miR-203水平明显下调，为胃癌根治术不良预后独立保护因素，联合检测可提升不良预后评估价值。本研究局限性在于为单中心研究，同时胃癌根治术患者预后影响因素较多，未全部纳入分析，此外，有关miR-144、miR-203 在胃癌根治术中不良预后的作用机制还有待进一步研究。