羊衣原体病检测方法的研究进展

曲 磊，魏 天，王成宇，王思月，肖 丹，张芳毓，王永志

吉林省农业科学院畜牧兽医研究所，吉林长春 130118

羊衣原体病是由衣原体引起的一种亚急性、感染性疾病，在我国各地均有发生，任何品种、日龄和性别的羊均能感染，母羊和羔羊的易感性相对较高。该病主要通过排泄物（如粪便、尿液）、分泌物（如泪液、鼻液）、流产胎儿、呼吸道（污染的尘埃、气溶胶）及破损的皮肤、黏膜等感染其它健康羊只。另外，羊的自身免疫机能强弱也是患羊衣原体病的原因之一，免疫能力越弱，患病概率就越大，免疫能力弱可能与饲养管理不当、环境卫生不良、摄取营养不均等有关。羊感染后体内持续带菌，感染初期无明显临床表现，怀孕母羊通常在妊娠后期流产、产弱羔或死胎等，临床上还较多见关节炎、结膜炎或胸膜肺炎等症状，严重制约了养羊业的快速健康发展。

为了有效遏制羊衣原体病的广泛传播、扩散，开展早期检测意义重大。目前，针对羊衣原体病的检测方法主要为病原学检测、血清学检测及核酸检测3 个方面。本文就上述检测方法逐一论述，为检测羊衣原体病提供参考。

1 病原学检测

1.1 病原分离培养

病原分离培养主要为鸡胚分离法、细胞培养法和小鼠接种等方法。鸡胚分离法技术成熟，将处理后的0.4 mL 样品接种到7日龄鸡胚卵黄囊中，置37 ～38.5 ℃环境下孵育，收集接种后4 ～7 d 出现规律性死亡的卵黄囊膜涂片，观察是否有衣原体染色颗粒。

细胞分离法对细胞生存环境非常严格，流产衣原体常用McCoy、BGM 和BHK 细胞分离，将处理后的病料接种至单层细胞，37 ℃、5% CO2条件下孵育2 h，2 ～3 d 后染色镜检鉴定。

遇污染严重病料，可选择3 ～4 d 的小白鼠，采用腹腔注射0.5 ～1 mL、脑内接种0.02 mL 或滴鼻2 ～3 滴方式接种，腹腔注射4 ～7 d 后，剖检取脏器表面淡灰黄色、黏稠的渗出液染色镜检鉴定，以脑、肺、肝、脾涂片也可观察到衣原体。

病原的分离始终被认为是诊断衣原体感染的“金标准”和最敏感的检测方法，也可以对毒株进行适当的分型，但缺点是对生物样本的采集、储存及运输要求较高，需要依靠专业技术人员及培养设施，确诊时间较长，同时需要考虑安全问题。

1.2 病原的鉴定

无菌条件下，将可疑病畜的胎盘、流产胎儿、阴道拭子等组织直接涂片，通过染色镜检法鉴定病原，常用方法有姬姆萨氏染色法、碘染色法等。姬姆萨染色技术简单，特异性较高。采集的样本涂片甲醇固定，用稀释后的姬姆萨染色液染色，无菌生理盐水冲洗，自然风干，通过光学显微镜的油镜观察到包涵体中的原生小体呈紫红色，不具有感染性的网状体呈蓝紫色。碘染色法与姬姆萨染色类似，样本涂片后经甲醇固定，碘染后，油镜观察可以看到紫红色的原生小体颗粒和蓝色的网状体颗粒。直接染色镜检观察较直观，但缺点是灵敏度很低，适用于感染较严重的组织。此外，流产衣原体的染色特征与柯克斯体相似，存在误检、漏检的可能，不适合大规模的检测。

直接免疫荧光试验，将荧光标记的多克隆抗体或单克隆抗体滴到涂片上，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3 遍，自然晾干后，荧光显微镜下观察绿色荧光的包涵体即可确诊为阳性。该方法的优点是特异性高、操作简单、用时较短；缺点是对仪器要求较高，敏感性较差。

酶免疫测定法（EIA）利用衣原体抗原与酶标抗体的特异性反应，当加入酶的底物出现特征性的反应即判定为阳性，优点是时间短，适合批量检测；缺点是易与其它微生物发生交叉反应。

2 血清学检测

2.1 补体结合实验(CFT)

CFT 是最常用的血清学检测方法之一，该检测方法操作繁琐特异性强，也常用作于衣原体性质识别以及抗原（抗体）研究。该试验原理包括反应系统、补体系统和指示系统。首先，反应系统与补体作用，随后，指示系统利用剩余补体反应。若反应系统中有抗体或抗原，则形成免疫复合物而固定和消耗补体，使随后加入的指示系统无多余补体可利用，则无溶血反应发生，反之亦然。不溶血为补体结合试验阳性。但由于参与反应的成分多，影响因素复杂，运用该方法有时候会得到假阳性的结果。

2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA）

ELISA 主要是用已知酶标记的抗体或抗原去检测与某种固相载体表面结合的未知抗体或抗原，根据反应颜色的深浅做定量或定性分析。在用此方法检测羊衣原体时，由于衣原体脂多糖（LPS）抗原与一些革兰氏阴性菌上的表位一致，故会出现假阳性的可能。为防止假阳性的出现，可以考虑用含有特异性单克隆抗体的ELISA 试剂盒，但此试剂盒灵敏度较低，需样本浓度较高。

2.3 间接血凝试验(IHA）

将羊衣原体抗原(抗体)包被于绵羊红细胞表面，成为致敏的载体，然后再加入相应的抗体（抗原）结合，出现肉眼可见的凝集，即为IHA。IHA 的优势在于检测效率高、敏感性好，在临床上得到广泛应用，在羊衣原体血清学调查方面起到至关重要的作用。

2.4 胶体金免疫层析技术(GICA）

GICA 是一种成本低、易操作、高特异性、肉眼判定的检测方法。它是以胶体金为显色媒介，应用于抗原抗体特异性结合的一种新免疫标记技术，它需要在层析过程中完成这一反应，原理与ELISA试剂相似，适用于现场检测，结果可迅速判定。

3 核酸检测

3.1 基因探针检测法

基因探针即核酸探针，是已知且带有检测标记的，与目的基因互补的DNA 或RNA 片段。其检测方法操作繁琐、灵敏性较高。现已有上市的商品化试剂盒。用基因探针检测法来检测衣原体，主要是检测羊衣原体单链RNA。

3.2 聚合酶链式反应(PCR）

PCR 是实验室最常用的核酸检测方法，应用于体外扩增目的基因片段，此方法经过三个基本反应（变性、退火、延伸），用于定性或半定量检测。PCR 以速度快、灵敏度高、特异性强等特点被广泛应用于国内外衣原体的检测中。

3.3 荧光定量PCR(qPCR)

qPCR 是在传统的凝胶电泳PCR 方法的基础上，极大提高了检测的特异性和敏感性，适用于定量分析。它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。此方法在检测衣原体的外膜主要蛋白基因和多形态膜蛋白基因方面得到广泛应用。

3.4 环介导等温扩增(LAMP）

LAMP 不仅是一种新的核酸扩增技术，而且在分子生物学检测领域得到广泛应用，它是一种成本低、特异性强、不依赖任何仪器设备、适合临床大批量检测的高通量快速检测方法。它的特征是根据靶基因上的六个区域来设计的四条引物，利用链置换Bst DNA 聚合酶进行恒温扩增反应，15 ～60 min可实现指数级的扩增，通过反应扩增产物的有无来判断靶基因是否存在。

3.5 限制性片段多态性分析(RFLP）

RFLP 是一种操作复杂、成本高、检测结果可靠、适合小规模检测的DNA 标记技术。它是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小，再将这些片段电泳、转膜、变性，与标识标记过的探针进行杂交，洗膜，即可分析其多态性结果。

3.6 DNA 微阵列

DNA 微阵列是将大量的探针分子固定于载体上后与标记的待测样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度从而获得待测样品分子的数量和序列信息。该技术能进行高通量的检测，但不能在多细胞类型组织中对待检的基因精确定位进行判断。目前，检测流产衣原体的DNA 微阵列商品化产品很多。该技术主要流程为芯片的制备、样品的制备、杂交反应及芯片信号的检测与分析。

4 小结

羊衣原体病不仅给养羊业造成巨大的经济损失，而且还是重要的人畜共患传染性疾病，危害着人类和家畜的健康安全。检测羊衣原体病的方法非常重要，它可以有效地遏制传染源、降低患病风险。羊衣原体检测技术经过流行病学调查、分离鉴定、免疫学检测到现在的分子生物学检测，检测技术越来越多。本研究主要讲述病原学、血清学及核酸检测方法在检测羊衣原体方面发挥的作用，虽部分检测方法存在一些缺点，但可为检测羊衣原体病提供参考。