GLCCI1基因rs37973位点多态性对ICSs治疗哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠效果的影响Δ

邱彦 ，董雅芬 ，于平 ，王建 ，卞晓岚 #（.上海市浦东新区人民医院药剂科，上海 000；.上海交通大学医学院附属瑞金医院药剂科，上海 0005）

哮喘和慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）都是常见的慢性气道炎症性疾病。据统计，全球约有哮喘患者2.6亿人、COPD患者2.1亿人[1]，且部分患者既有COPD的临床表现，又有哮喘的疾病特征。2014年，《慢性阻塞性肺病全球倡议（GOLD）》和《全球哮喘防治倡议（GINA）》联合提出哮喘-COPD重叠综合征（asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndrome，ACOS）的概念，即持续的气流受限，并同时具备哮喘与COPD的多项临床特征[2]，但ACOS作为单一疾病定义存在较大争议。2017年，GOLD和GINA又共同提出“哮喘-COPD重叠（asthmachronic obstructive pulmonary disease overlap，ACO）”术语，用以描述同时具有哮喘和COPD疾病特征的患者[3]。与单纯的哮喘或COPD相比，ACO患者的肺功能更差，急性加重更频繁，呼吸道症状更严重，带来的社会和经济负担更大[4—5]。

吸入性糖皮质激素（inhaled corticosteroids，ICSs）联合支气管扩张剂为治疗ACO的推荐方案[6]。然而，不同患者对ICSs的应答存在较大的个体差异[7]。一项全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）表明，在非西班牙裔白种人中，GLCCI1基因rs37973位点突变与哮喘患者对ICSs的应答显著下降具有相关性[8]。近期研究表明，rs37973位点多态性不仅与哮喘患者使用ICSs的短期或长期临床疗效差异相关，还与COPD患者对ICSs的应答差异相关[9—10]。目前，关于ACO患者基因特征相关性的报道较少[11]。为进一步了解ACO患者的临床疾病特点和遗传学相关特征，本研究探讨了GLCCI1基因rs37973位点多态性与ACO患者使用ICSs应答反应的相关性，旨在为ACO患者使用ICSs的疗效预测及个体化治疗方案的优化提供参考。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准

本研究的主要纳入标准包括：（1）年龄≥40岁，存在持续气流受限[使用支气管扩张剂后，第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1）与用力肺活量（forced vital capacity，FVC）比值＜0.70]；（2）吸烟史（或同等空气污染暴露，如燃料烟雾、职业粉尘等）＞10年；（3）40岁以前诊断为哮喘或者使用支气管扩张剂后FEV1改善＞0.4 L。次要纳入标准包括：（1）有特应性疾病（如过敏性结膜炎、特应性皮炎、过敏性鼻炎等）病史；（2）14 d内支气管舒张试验阳性≥2次；（3）外周血嗜酸性粒细胞计数≥0.3×109L-1。满足主要标准3项和次要标准至少1项者纳入本研究[6]。

表1 ACO患者的基本资料

本研究的排除标准为：（1）14 d内有急性加重事件（呼吸道症状急性恶化）者；（2）4周内接受过系统性糖皮质激素治疗（口服或者静脉用药）者；（3）除COPD及哮喘外，合并其他慢性肺部疾病者。

1.2 研究对象

选取2019年4月1日至2020年12月31日就诊于上海市浦东新区人民医院并首次诊断为ACO的173例患者，其中，62例患者因各种原因（如中途要求退出、失访、拒绝配合检测等）未能完成24周的随访，最终纳入111例。111例ACO患者中，男性75例（67.57%）、女性36例（32.43%），年龄（66.32±13.74）岁，体重指数（body mass index，BMI）（23.04±3.93）kg/m2，吸烟史（31.27±12.75）包年，78例（70.27%）患者吸烟史超过20包年。患者基本资料见表1。本研究方案经医院医学伦理委员会审核批准，伦理批件号为：prylz2020-079b。所有患者均签署了知情同意书。

1.3 用药方法

所有患者均使用沙美特罗替卡松吸入粉雾剂（法国Glaxo Wellcome Production，批准文号H20150325，每泡含昔萘酸沙美特罗50 μg与丙酸氟替卡松500 μg，递送剂量为昔萘酸沙美特罗47 µg与丙酸氟替卡松460 µg），每天2次，每次1吸，持续24周。

1.4 观察指标

采用MS-Diffusion型肺功能仪（德国Jeager公司）测定肺功能，肺功能指标包括FEV1、FVC、FEV1% pred[12]。以ICSs治疗后肺功能指标与基线指标的差值作为肺功能改善指标，分别用ΔFEV1和ΔFEV1% pre表示。

1.5 基因型检测方法

采集患者外周静脉血2 mL，采用基因组DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司）提取DNA，于-80 °C保存。rs37973位点多态性检测采用MassARRAY DNA质谱阵列基因分析系统（美国Agena Bioscience公司）完成分型。引物序列如下：前引物（1st-PCRP）ACGTTGGATGCACGAGCAGACCAATTTGAC；后引物（2nd-PCRP）ACGTTGGATGCGGGAGCAATTAATGTAAGG；单碱基延伸反应物（UEP_SEQ）GGCAATTAATGTAAGGATCTTCATC。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃最终延伸5 min，共45个循环。

1.6 统计学方法

使用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。等位基因频率通过Hardy-Weinberg平衡检验比较实际分布与理论分布的差异，采用χ2检验。符合正态分布的计量资料以±s表示，计数资料以例数及构成比（%）表示。计量资料两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），组间两两比较采用Bonferroni检验（假定方差齐性）和Tamhane’sT2检验（假定方差不齐）。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 患者GLCCI1基因rs37973位点基因分型结果

GLCCI1基因rs37973位点AA型患者有42例（37.84%），AG型有52例（46.85%），GG型有17例（15.32%），符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。结果见表1。

2.2 治疗前患者的基线肺功能

2.2.1 治疗前患者基线肺功能指标的总体情况

治疗前，患者的基线总体FEV1、FEV1% pred、FEV1/FVC分别为（1.39±0.35）L、（49.71±12.22）%、0.50±0.09。各基因型患者的基线肺功能指标及外周血嗜酸性粒细胞计数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

2.2.2 治疗前不同吸烟史患者的基线肺功能指标比较

治疗前，吸烟史≤20包年患者的基线总体FEV1和FEV1% pred分别为（1.55±0.22）L、（54.92±7.82）%，均显著优于吸烟史＞20包年患者[FEV1和FEV1% pred分别为（1.33±0.37）L、（47.51±13.09）%，P＜0.05]。但二者的基线总体FEV1/FVC[吸烟史≤20包年患者为（0.50±0.08），吸烟史＞20包年患者为（0.49±0.09）]比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2.3 治疗前不同吸烟史各基因型患者的基线肺功能指标比较

治疗前，吸烟史≤20包年患者中，AA+AG型患者的基线FEV1和FEV1% pred均显著优于GG型患者（P＜0.05）（图1A、图1B），但二者的基线FEV1/FVC（AA+AG型为0.51±0.08，GG型为0.49±0.08）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。吸烟史＞20包年患者中，AA+AG型患者的基线FEV1、FEV1% pred与GG型患者比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（图1C、图1D）；而AA+AG型患者的基线FEV1/FVC显著优于GG型患者（AA+AG型为0.51±0.09，GG型为0.45±0.07，P＜0.05）。

图1 治疗前不同吸烟史各基因型患者的基线肺功能

2.3 治疗后患者的肺功能

2.3.1 治疗后患者肺功能指标的总体情况

治疗12周后，患者的总体FEV1、FEV1% pred、FEV1/FVC分别为（1.57±0.37）L、（55.22±12.84）%和0.52±0.09；治疗24周后，患者的总体FEV1、FEV1% pred、FEV1/FVC分别为（1.64±0.35）L、（57.67±12.45）%和0.53±0.09，上述肺功能指标总体情况均显著优于治疗前患者的基线肺功能指标总体情况（P＜0.05）。

2.3.2 治疗后各基因型患者肺功能指标比较

治疗12、24周后，AA型患者FEV1、FEV1% pred均显著高于GG型患者（P＜0.05）；AA型与AG型、AG型与GG型患者的FEV1、FEV1% pred及各基因型患者的FEV1/FVC比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

表2 治疗后各基因型患者肺功能指标结果（±s）

表2 治疗后各基因型患者肺功能指标结果（±s）

a：与GG型比较，P＜0.05。

肺功能指标FEV1/L rs37973位点分型治疗时间12周24周12周24周12周24周FEV1% pred/%FEV1/FVC GG 1.35±0.31 1.39±0.33 48.15±10.84 49.45±11.42 0.49±0.09 0.50±0.09 AA 1.67±0.40 a 1.75±0.36 a 59.39±14.24a 62.51±12.81a 0.52±0.10 0.54±0.11 AG 1.57±0.32 1.64±0.31 54.16±11.12 56.46±10.85 0.53±0.08 0.54±0.10

2.3.3 治疗后各基因型患者肺功能改善情况

治疗12周后，各基因型患者的肺功能改善情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗24周后，AA型、AG型患者的肺功能改善情况均显著优于GG型，且AA型患者的ΔFEV1% pred显著优于AG型（P＜0.05）。结果见图2。

图2 治疗后各基因型患者的肺功能改善情况

2.3.4 治疗后不同吸烟史各基因型患者的肺功能改善情况

治疗12、24周后，吸烟史≤20包年患者的肺功能总体改善情况均显著优于吸烟史＞20包年患者（P＜0.05）。治疗12、24周后，吸烟史≤20包年患者中，仅AA型患者的ΔFEV1% pred显著优于AG型（P＜0.05）；其他各基因型患者的肺功能改善情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗12周后，吸烟史＞20包年患者中，AA型和AG型患者的ΔFEV1、ΔFEV1% pred均显著优于GG型，且AA型患者的ΔFEV1% pred显著优于AG型（P＜0.05）；治疗24周后，AA型和AG型患者的ΔFEV1、ΔFEV1% pred均显著优于GG型（P＜0.05）。结果见表3。

表3 不同吸烟史各基因型患者肺功能改善情况（±s）

表3 不同吸烟史各基因型患者肺功能改善情况（±s）

a：与吸烟史＞20包年比较，P＜0.05；b：与AG型比较，P＜0.05；c：与GG型比较，P＜0.05。

吸烟史≤20包年肺功能改善指标ΔFEV1/L治疗时间12周24周12周24周12周24周12周24周总体0.24±0.08a 0.29±0.11a 7.58±3.20a 9.64±4.17a 0.16±0.16 0.23±0.16 4.64±5.85 7.26±5.98 rs37973位点分型GG 0.17±0.14 0.19±0.09 6.15±5.04 7.03±3.45 0.01±0.21 0.06±0.19 0.45±7.61 1.98±6.81 ΔFEV1% pred/%＞20包年ΔFEV1/L ΔFEV1% pred/%AA 0.27±0.05 0.34±0.09 9.39±1.87b 11.94±3.05b 0.17±0.18c 0.27±0.17c 6.29±6.54bc 9.63±6.11c AG 0.24±0.05 0.30±0.11 6.70±2.65 8.83±4.47 0.18±0.10c 0.25±0.12c 4.55±3.88c 6.92±4.50c

3 讨论

20世纪50年代，医学工作者发现某些患者可能同时患有哮喘和COPD的情况[13]。1961年，“荷兰假说”被提出，该假说认为哮喘和COPD是同一气道阻塞性疾病在不同阶段的表现[6，14]，但这个假说在学术界存在争议。2014年，GOLD和GINA联合提出ACOS后，截至2020年，关于此类患者的研究较2014年前增加了5倍之多[15]。

GLCCI1位于第7号染色体短臂2区1带第3亚带（7p21.3），在全身多个组织器官中均有表达。糖皮质激素诱导转录蛋白1抗体（glucocorticoid induced transcript 1，GLCCI1）可被糖皮质激素诱导，被认为是糖皮质激素诱导凋亡的早期标志物之一[8，16]。位于GLCCI1基因启动子区域的rs37973位点单核苷酸突变，可能会下调GLCCI1基因的表达，减少炎症细胞因子凋亡，从而导致机体对ICSs的治疗反应较差[8]。此外，GLCCI1基因突变被认为是肺功能下降（FEV1每年下降≥30 mL）的危险因素之一[17]。rs37973位点多态性显性模型（AA+AG vs.GG）分析结果表明，采取类似的治疗措施，GG型哮喘患者肺功能下降更快[7—9]。本研究发现，虽然治疗前各基因型患者肺功能指标未见显著性差异，但在吸烟患者中，AA+AG型患者的部分肺功能指标优于GG型，表明吸烟、基因型可能是影响患者肺功能的因素。在COPD患者中，rs37973位点多态性也可能是预测患者对ICSs治疗反应的潜在因子[10]。目前认为，可能存在同时影响哮喘和COPD的遗传学因素和环境因素[18]。本研究结果显示，各基因型患者的基线肺功指标无明显差异，但治疗24周后，AA型和AG型患者的肺功能改善情况均显著优于GG型，这提示野生纯合子（AA型）和杂合子（AG型）患者对ICSs的治疗反应优于突变纯合子（GG型）患者，位点基因多态性与ICSs治疗的疗效相关。在24周的随访中，除个别患者出现口咽部不适、声音嘶哑外，未见严重不良反应发生。

既往研究表明，吸烟状态与肺功能加速恶化有关[19]。本研究中发现，吸烟史对各基因型患者的基线肺功能指标和ICSs治疗反应均有影响。吸烟史≤20包年患者的基线总体FEV1和FEV1% pred均显著优于吸烟史＞20包年患者；治疗12、24周后，吸烟史≤20包年患者的肺功能总体改善情况显著优于吸烟史＞20包年患者。此外，治疗12、24周后，吸烟史＞20包年患者中的AA型和AG型患者的肺功能改善情况均优于GG型。这提示，在合并重度吸烟史的患者中，AA型和AG型患者对ICSs应答较GG型更好。

本研究的局限性为：（1）ACO尚无统一的诊断标准，这可能会增加纳入患者之间的差异性。在ACO患者中，有两种亚型被提出，一种是吸烟相关的COPD合并2型辅助性T细胞（type 2 helper T，Th2）介导的Th2型炎症表现患者，称为Th2型COPD（或者嗜酸性粒细胞型COPD）；一种是哮喘患者有吸烟史或者长期空气污染暴露，逐步表现出COPD的临床特征[20]。目前尚无法明确区分这两种亚型，而这两种亚型的患者对ICSs的应答可能存在差异，从而增加研究结果的偏倚。（2）在ACO患者中尚缺乏关于ICSs疗效的GWAS研究。本研究仅关注了单核苷酸多态性，纳入的样本量较少，不能完全解释ICSs应答的个体差异，且ACO患者经ICSs治疗的临床获益机制还需进一步研究。（3）基于药物的易获得性，本研究以沙美特罗替卡松代表ICSs，所得结果是否可外推到其他ICSs暂不清楚。（4）支气管扩张剂联合ICSs治疗可能会影响ICSs的疗效。在后续研究中，本课题组将进一步完善GLCCI1基因rs37973位点单倍型研究和体外荧光素酶报告基因试验，并评价突变位点对GLCCI1基因表达及炎症细胞因子凋亡的影响，以探索不同基因型对ICSs应答差异的机制。

综上所述，GLCCI1基因rs37973位点GG型ACO患者对ICSs的治疗反应较其他基因型差，其中吸烟史＞20包年的患者反应更差。