暗褐网柄牛肝菌化学成分及其抗肿瘤细胞毒活性

陈招莉，符大天，张 蕾，谭林燕，符秀娟

（1.海南省妇女儿童医学中心，海南 海口 570206； 2.海南医学院第一附属医院，海南 海口 570102；3.海南职业技术学院，海南 海口 570216）

牛肝菌因其肉质肥厚，极似牛肝而得名，为“四大菌王” 之一，主要分布于全球热带和亚热带地区，包括泰国、老挝、缅甸、斯里兰卡、印度尼西亚、墨西哥、澳大利亚等［1-2］。我国牛肝菌种质资源丰富，主要分布于广东、广西、海南、云南、贵州、四川等地［3］。《滇南本草》 是我国最早记载牛肝菌的医药典籍，其记载“牛肝菌，气味微酸、辛、平，主治清热解烦，养血和平”［4］。现代研究表明，牛肝菌包括华丽牛肝菌、考夫曼网柄牛肝菌、茶褐牛肝菌等含有丰富的化学成分，包括甾体、黄酮、萜类、多酚等多种活性成分，其中麦角甾体是牛肝菌中特征性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降血糖、保肝利胆、提高人体免疫力、调节内分泌等作用［5-9］。

暗褐网柄牛肝菌又名暗褐脉柄牛肝菌，商品名黑牛肝菌，隶属于牛肝菌目小牛肝菌科脉柄牛肝菌属，主要分布于云南、海南等地，其个体肥大，味道鲜美，营养丰富，是备受群众喜爱的一种牛肝菌，具有很好的开发潜力［10］。然而，有关暗褐网柄牛肝菌的化学成分报道较少，仅见Sun 等［11］从中分离得到7 种吡咯类成分。基于海南热带岛屿暗褐网柄牛肝菌资源的优势，对该真菌进行化学成分研究，从其95%乙醇提取物中分离鉴定了4 个麦角甾烷型甾体类化合物，其中化合物1 为新化合物，并具有一定妇科癌细胞毒活性，为该类高等真菌资源的进一步开发和利用提供了一定的参考和科学依据。

1 材料

AVANCE 600 MHz 核磁共振仪（德国Bruker公司）； 高分辨质谱仪Q-tof （美国Waters 公司）；Spectrum Two FT-IR 红外光谱仪 （美国Perkin Elmer 公司）； EVO300 紫外分光光度计 （美国Thermo Scientific 公司）； SGW-1 自动旋光仪（上海精科物光仪器有限公司）； P3000 型HPLC 仪（北京创新通恒科技有限公司）； 制备型C18色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司）； 200 ～300 目柱色谱硅胶、硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司）。甲醇（批号B2209091）、二氯甲醇 （ 批号 B2209241 ）、乙酸乙酯 （ 批号B2207021）、石油醚 （批号2211027）、正丁醇（批号1811241） 为分析纯（西陇科技股份有限公司）； 水（杭州哇哈哈集团有限公司）。

RPMI1640 培养基 （批号SH30809.01，美国Cytiva 公司）； 人肝癌细胞株HepG2 （批号CL-0103）、人肺癌细胞株A549 （批号CL0016）、人宫颈癌细胞株HeLa （批号CL-0101）、人乳腺癌细胞株MCF-7 （批号CL-0149）、人三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231 （批号CL-0150A） （武汉普诺赛生命科技有限公司）。

新鲜暗褐网柄牛肝菌子实体收集于海南省海口市，经海南医学院药学院李慧研究员鉴定为暗褐网柄牛肝菌Phlebopusportentosus，标本保存于海南医学院中药室标本馆（编号20190618PP）。

2 提取与分离

取干燥暗褐网柄牛肝菌子实体粉末350.0 g，95%乙醇冷浸提取3 次，滤过，减压回收溶剂，浓缩后得总浸膏34.5 g，乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯，减压浓缩得到相应部位20.8 g，经硅胶柱层析，以石油醚-二氯甲烷（100 ∶0 ～0 ∶100） 梯度洗脱，得Fr.A ～Fr.F。Fr.C 经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇（90 ∶1 ～0 ∶100） 梯度洗脱，得Fr.C-1～Fr.C-7，Fr.C-2 经半制备HPLC 分离纯化，以甲醇-水（85 ∶15） 洗脱（体积流量2.0 mL/min，检测波长210 nm），得到化合物1 （5.8 mg，tR＝16.6 min）； Fr.C-3 经半制备HPLC 分离纯化，以甲醇-水（85 ∶15） 洗脱（体积流量2.0 mL/min，检测波长210 nm），得到化合物2 （4.7 mg，tR＝20.5 min）。Fr.D 经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶1 ～0 ∶100） 梯度洗脱，得Fr.D-1 ～Fr.D-6，Fr.D-3 经半制备HPLC 分离纯化，以甲醇-水（85 ∶15） 洗脱（体积流量2.0 mL/min，检测波长210 nm），得到化合物3 （6.5 mg，tR＝21.4 min）；Fr.D-4 经半制备HPLC 分离纯化，以甲醇-水（80 ∶20） 洗脱 （体积流量2.0 mL/min，检测波长210 nm），得到化合物4 （7.2 mg，tR＝26.4 min）。

3 结构鉴定

化合物1： 白色粉末，易溶于甲醇、氯仿等，HR-ESI-MSm/z： 467.313 2 ［M ＋Na］＋，分子式C28H44O4，不饱和度7。UV（甲醇）λmax（logε） ＝246 （0.65） nm； IR （KBr）νmax＝3 440、2 932、1 660、1 615、1 455、1 373、1 054、920 cm-1，表明存在羟基、共轭羰基等官能团。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）谱（表1） 中显示6 个甲基氢信号δ：1.11 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-19），1.05 （3H，s，H-20），0.94 （3H，d，J＝7.8 Hz，H-24），0.85（3H，d，J＝7.2 Hz，H-26），0.87 （3H，d，J＝7.2 Hz，H-27），1.04 （3H，s，H-28）； 7 个亚甲基氢信号δ： 1.67 （1H，m，H-2a），2.09 （1H，m，H-2b），1.34 （1H，m，H-4a），2.16 （1H，m，H-4b），1.58 （2H，m，H-6），2.38 （1H，m，H-7a），4.09 （1H，m，H-7b），1.80 （1H，m，H-11a），1.45 （1H，m，H-11b），1.33 （2H，m，H-12），2.08 （1H，m，H-16a），2.16 （1H，m，H-16b）； 2 个普通烯烃质子信号δ： 5.31 （dd，J＝15.0，7.8 Hz，H-21），5.23 （dd，J＝15.0，7.8 Hz，H-22）； 7 个次甲基氢信号δ： 3.61 （1H，dd，J＝4.8，1.8 Hz，H-1），4.02 （1H，m，H-3），1.48 （1H，m，H-9），1.50 （1H，m，H-17），2.70 （1H，m，H-18），1.88 （1H，m，H-23），2.24 （1H，m，H-25）。结合13C-NMR （150 MHz，CD3OD） （表1） 和HSQC 图谱，可知有28个碳信号，包括6 个甲基碳信号δ： 20.6 （C-19），17.0 （C-20），16.8 （C-24），18.7 （C-26），19.1（C-27），18.1 （C-28）； 7 个亚甲基碳信号δ：39.7 （C-2），37.0 （C-4），19.0 （C-6），31.1（C-7），30.2 （C-11），31.9 （C-12），42.8 （C-16）； 9 个次甲基碳信号δ： 76.5 （C-1），65.7（C-3），32.9 （C-9），51.6 （C-17），42.9 （C-18），133.0 （C-21），134.6 （C-22），43.0 （C-23），39.3 （C-25）； 6 个季碳信号δ： 74.5 （C-5），150.6 （C-8），42.4 （C-10），40.9 （C-13），140.3 （C-14），207.5 （C-15）。

表1 化合物1 的1H-NMR、13C-NMR 数据Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data on compound 1

以上数据与文献［12-13］ 报道基本一致，具有相同的麦角甾烷型甾体类特征骨架结构，见图1。结合分子式信息，可知化合物1 与已知化合物（22E） -8，14-epoxyergosta-6，22-diene-3β，5α，9α-triol［12］的主要不同之处在于前者在C-1 位存在羟基取代，C-6、C-7 位之间存在双键还原，C-9 位存在羟基还原，C-8、C-14、C-15 位之间存在α，β-不饱和酮结构片段。

图1 化合物1 的结构Fig.1 Structure of compound 1

1H-1H COSY 谱（图2） 显示，H-6 （δH1.58）与H-7 （δH2.38，4.09），H-9 （δH1.48）、H-11（δH1.80，1.45） 与H-12 （δH1.33） 相关，推测该结构中C-6、C-7 位间存在-CH2-CH2-，C-9、C-11、C-12 位间存在-CH-CH2-CH2-。HMBC 谱（图2） 中H-2 （δH1.67，2.09） 与C-1 （δC76.5）、C-3 （δC65.7） 远程相关，结合其化学位移以及化合物的分子量，判断C-1、C-3 位存在羟基取代； H-7（δH2.38，4.09） 与C-8 （δC150.6）、C-14 （δC140.3） 远程相关，H-16 （δH2.08，2.16） 与C-14、C-15 （δC207.5） 远程相关，结合C-8、C-14、C-15 位的化学位移，推断三者之间以α，β-不饱和酮的形式连接。结合HMBC、1H-1H COSY 等二维图谱中的其他关键相关信号，确定化合物1 的平面结构，见图2。

图2 化合物1 的1H-1H COSY 和HMBC 主要相关Fig.2 Key correlations between 1H-1H COSY and HMBC of compound 1

为了进一步确定其绝对构型，参考该类化合物的生物合成途径及在B3LYP/6-31 G （d） 基组的水平，发现ECD 图谱与化合物1 的图谱一致（图3），确定其绝对构型为1S，3S，5R，9S，10S，13R，17R，18R，23R，是新化合物，命名为phlesterol A。

图3 化合物1 的实测和计算ECD 谱图Fig.3 Measured and calculated ECD spectra of compound 1

化合物2： 白色粉末，ESI-MSm/z： 451.3［M＋Na］＋，分子式C28H44O3Na。1H-NMR （ 600 MHz，CDCl3）δ： 3.93 （1H，m，H-3），6.21（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6），6.45 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），0.85 （ 3H，s，H-18），1.20（3H，s，H-19），0.96 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），5.11 （1H，dd，J＝8.4，15.0 Hz，H-22），5.19 （1H，dd，J＝8.4，15.0 Hz，H-23），0.79（3H，d，J＝6.0 Hz，H-26），0.77 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-27），0.87 （3H，d，J＝7.2 Hz，H-28）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 34.9 （C-1），30.3 （C-2），66.7 （C-3），37.1 （C-4），82.4 （C-5），135.6 （C-6），130.9 （C-7），79.6（C-8），51.2 （C-9），37.0 （C-10），23.6 （C-11），39.5 （C-12），44.7 （C-13），51.9 （C-14），20.2 （C-15），28.9 （C-16），56.4 （C-17），13.1（C-18），18.4 （C-19），39.5 （C-20），20.8 （C-21），135.4 （C-22），132.5 （C-23），43.0 （C-24），33.3 （C-25），19.9 （C-26），18.4 （C-27），17.8 （C-28）。以上数据与文献［14］ 报道基本一致，故鉴定为过氧化麦角甾醇。

化合物3： 白色粉末，ESI-MSm/z： 453.3［M＋Na］＋，分子式C28H46O3Na。1H-NMR （ 600 MHz，CDCl3）δ： 5.27 （1H，m，H-7），5.19（2H，m，H-22 ～23），3.97 （1H，m，H-3），3.54 （1H，m，H-6），1.05 （3H，s，H-19），1.02 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.91 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.84 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-27），0.82 （3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.62（3H，s，H-18）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ：143.7 （C-8），136.7 （C-22），132.9 （C-23），118.7 （C-7），76.8 （C-5），73.9 （C-6），68.2（C-3），57.1 （C-17），55.7 （C-14），44.5 （C-13），44.0 （C-24），44.0 （C-24），41.5 （C-20），40.4 （C-13），40.1 （C-12），37.9 （C-10），34.1（C-25），33.7 （C-2），31.4 （C-1），29.0 （C-16），23.8 （C-15），22.8 （C-11），21.7 （C-21），20.5 （C-27），20.1 （C-26），18.9 （C-19），18.2（C-28），12.8 （C-18）。以上数据与文献［15］ 报道基本一致，故鉴定为（22E，24R） -7，22-二烯-3β，5α，6β-麦角三醇。

化合物4： 白色粉末，ESI-MSm/z： 419.3［M＋Na］＋，分子式C28H44ONa。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 5.16 （1H，m，H-7），0.57 （3H，s，H-18），1.01 （3H，s，H-19），1.05 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），5.20 （1H，m，H-22），5.24（1H，m，H-23），0.80 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.83 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-27），0.90（3H，d，J＝7.2 Hz，H-28）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 38.9 （C-1），38.3 （C-2），212.2 （C-3），44.4 （C-4），43.0 （C-5），30.2 （C-6），117.1 （C-7），139.7 （C-8），49.0 （C-9），34.6（C-10），21.9 （C-11），39.5 （C-12），43.4 （C-13），55.2 （C-14），23.1 （C-15），28.2 （C-16），56.1 （C-17），12.3 （C-18），12.6 （C-19），40.6（C-20），21.3 （C-21），135.7 （C-22），132.1（C-23），43.0 （C-24），33.2 （C-25），20.1 （C-26），19.8 （C-27），17.7 （C-28）。以上数据与文献［16］ 报道基本一致，故鉴定为麦角甾-7，22E-二烯-3-酮。

4 抗肿瘤细胞毒活性研究

采用MTT 法［17］，以紫杉醇为阳性对照，测定化合物1 ～4 对人肝癌细胞株HepG2、人肺癌细胞株A549、人宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞株MCF-7、人三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231 的细胞毒活性。选择对数生长的肿瘤细胞，用RPMI1640培养基培养，以5.0×103/孔的密度接种于96 孔板上，每孔100 μL，在5%CO2、37 ℃孵育箱中培养48 h，加入不同浓度的待测样品（设空白对照组、阳性对照组），继续培养48 h 后吸出原培养基，加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL，孵育4 h 后吸出MTT 溶液，加入100 μL DMSO，低速振荡5 min，在570 nm 波长处检测吸光度（A），计算肿瘤细胞生长抑制率，重复3 次，计算IC50值。

结果，化合物1 ～4 对HepG2、A549 细胞毒活性不显著，IC50值均大于20.0 μmol/L； 化合物1对妇科癌细胞HeLa、MCF-7 的抑制活性较强，IC50值为6.45 ～8.38 μmol/L，对MDA-MB-231 细胞具有一定的细胞毒活性，其IC50值为14.84 μmol/L，见表2。

表2 各化合物对肿瘤细胞的细胞毒活性（±s，n＝3）Tab.2 Cytotoxic activities of various compounds on tumor cells （±s，n＝3）

表2 各化合物对肿瘤细胞的细胞毒活性（±s，n＝3）Tab.2 Cytotoxic activities of various compounds on tumor cells （±s，n＝3）

注： 与紫杉醇比较，**P＜0.01。

化合物IC50/（μmol·L-1）HepG2A549HeLaMCF-7 MDA-MB-231 1 30.48±1.62**27.58±1.45**6.45±0.68**8.38±0.55**14.84±1.15**2 35.65±2.18**22.64±2.35**12.82±1.25**15.38±1.84**19.76±1.33**3 32.87±2.64**24.88±2.14**16.05±2.06**15.84±1.25**22.56±2.08**4 42.58±2.55**38.56±2.18**25.84±1.86**19.63±1.08**28.62±2.05**紫杉醇2.54±0.251.64±0.150.88±0.221.23±0.214.48±0.36

5 结论

本研究通过色谱分离技术及天然产物结构鉴定方法，从暗褐网柄牛肝菌中分离鉴定4 个麦角甾烷型甾体类化合物，其中化合物1 为新化合物； 采用MTT 法测定了化合物1 ～4 对HepG2、A549、HeLa、MCF-7、MDA-MB-231这5 种肿瘤细胞毒活性，发现化合物1 对妇科癌细胞具有一定的细胞毒活性。本研究丰富了暗褐网柄牛肝菌的化学成分，发现了其体外细胞毒活性，为其进一步开发利用积累了基础数据。