醋延胡索炮制过程中色度值与生物碱含量相关性研究

杜伟锋，赵明方，汤璐璐，洪 浩，葛卫红，李昌煜，张叶峰

（1.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 311402； 2.浙江中医药大学中药炮制技术研究中心，浙江 杭州 311401； 3.浙江中医药大学饮片有限公司，浙江 杭州 311401； 4.浙江中医药大学中医药科学院，浙江 杭州 310053； 5.宁波市中药饮片有限公司，浙江 宁波 315336）

延胡索为罂粟壳紫堇碱植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥块茎，具有活血、行气、止痛功效［1］。临床常用于治疗脘腹疼痛、胸痹心痛、经闭痛经、产后淤阻等症［2］。延胡索始载于《本草拾遗》［3］，主产于浙江东阳、磐安、永康等地，陕西、安徽等地也有栽培［4］。其有效成分为季胺类、叔胺类生物碱，另外还含有糖类、淀粉、氨基酸等［5-9］。生延胡索生物碱成分难溶于水，溶出率较低，临床药效不显著，经醋炙后，醋酸与生物碱形成可溶性醋酸盐，有利于煎煮时溶出，疗效增强［10-12］。

外观颜色的差异常常反映着药材质量的不同，而且与药材内在物质成分含量也有密不可分的关系［13-15］。随着现代技术的发展，色差仪、电子鼻等表征识别设备被越来越多的应用到中药材鉴别中［16-17］。色差计是通过模拟人眼视觉系统，结合仪器内部的模拟积分光学系统，得到L*、a*、b*［18-19］，L*为亮度值，L*值越大，饮片色泽越白； a*表示红绿色度，a*值越大，饮片颜色越红，反之越绿； b*表示黄蓝色度，b*值越大，饮片颜色越黄，反之越蓝［20］。

本实验对醋延胡索炮制不同时间点的色度值L*、a*、b*及原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素含量进行检测，分析醋延胡索外观颜色与其化学成分的相关性，建立以量化颜色快速评价醋延胡索炮制程度的方法，以期为醋延胡索炮制过程的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 U3000 型高效液相色谱仪 （美国Thermo Fisher 公司）； NT-xs105 型、ME-204E 型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； DFD-700型电热恒温水浴锅 （天津市泰斯特仪器有限公司）； CGY-750H 型自控温鼓式炒药机（杭州海善制药设备股份有限公司）； CM-5 型分光测色仪（日本柯尼卡美能达公司）； EOS-50D 型数码单反相机（日本佳能公司）； MIL-SYN 型超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂 原阿片碱 （纯度99.6%，批号110853-201805）、盐酸小檗碱（纯度86.7%，批号110713-201814）、盐酸巴马汀（纯度85.7%，批号110732-201913）、延胡索乙素（纯度99.9%，批号110726-201819） 对照品均购自中国食品药品检定研究院； 四氢小檗碱对照品 （纯度98%，批号190144-201907） 购自上海鸿永生物科技有限公司；去氢紫堇碱（纯度95%，批号30045-16-0）、延胡索甲素（纯度95%，批号518-69-4） 对照品均购自上海朗昭科技有限公司。

1.3 药材 3 批生延胡索饮片分别购自安徽省、山东省、陕西省中药饮片有限公司，经浙江中医药大学中药炮制技术研究中心葛卫红教授鉴定为正品。3 批醋延胡索饮片由对应生品按浙江中医药大学饮片有限公司生产工艺炮制而成。

2 方法与结果

2.1 醋制品制备 取生品适量，淋入米醋（每100 kg 生品用20 kg 米醋） 搅拌均匀，按醋炙法炒制（温度为170～180 ℃，以30 kg 为一锅，炒制时间为10～15 min），取出放凉。因本实验需包含炮制不及、炮制太过样品，故将炮制时间延长至30 min，每1 min 取样1 次，每次500 g 左右，打粉，过5 号筛，结果见图1。由此可知，生品呈明黄色，炮制不及样品呈棕褐色，醋制品呈黑色，炮制太过样品呈红棕色。

图1 延胡索饮片图Fig.1 Images of Corydalis Rhizoma decoction pieces

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取延胡索甲素、原阿片碱、盐酸小檗碱、四氢小檗碱、延胡索乙素、盐酸巴马汀、去氢紫堇碱对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，即得（各成分质量浓度分别为117.2、104.9、117.9、124.0、107.6、115.8、109.1 μg/mL）。

2.2.2 供试品溶液 取延胡索粉末（过3 号筛）约0.5 g，精密称定，置于平底烧瓶中，精密加入浓氨试液-甲醇（1 ∶20） 混合溶液50 mL，称定质量，冷浸1 h 后加热回流提取1 h，放冷，混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取25 mL续滤液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 Agilent ZORBAX-Extend-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相0.6%乙酸（三乙胺调pH 至5.0）（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0～22 min，17% ～22%B； 22～30 min，22% ～30%B； 30～50 min，30% ～50%B； 50 ～75 min，50% ～80%B）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温25 ℃； 检测波长280 nm。色谱图见图2。

图2 生延胡索（S1）、醋延胡索（S2）、对照品（S3）HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of raw Corydalis Rhizoma（S1），vinegar-processed Corydalis Rhizoma （S2）and reference substance （S3）

2.4 线性关系考察 分别取对照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL，置于1 mL 量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，得到系列质量浓度，在“2.3” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各生物碱在各自范围内线性关系良好。

表1 各生物碱线性关系Tab.1 Linear relationships of various alkaloids

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，在“2.3” 项色谱条件下进样测定6次，测得原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素峰面积 RSD 分别为 1.64%、0.55%、0.36%、0.43%、0.46%、0.95%、0.56%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取延胡索（产地陕西） 粉末适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、5、10、15、20、25 h 在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素峰面积 RSD 分别为 1.00%、0.61%、1.50%、0.72%、1.65%、1.73%、0.68%，表明溶液在25 h 稳定性良好。

2.7 重复性试验 取延胡索（产地陕西） 粉末适量，按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素峰面积RSD分别为0.39%、0.43%、1.12%、0.67%、0.69%、0.84%、0.87%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 称取各成分含量已知的延胡索粉末6 份，每份0.5 g，按1 ∶1 比例精密加入各对照品，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素平均加样回收率分别为99.77%、101.24%、100.73%、99.83%、100.13%、98.35%、100.71%，RSD 均小于2%。

2.9 样品含量测定 取各批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2、图3。由此可知，各生物碱含量在0 ～15 min 逐渐升高，15 min 后逐渐降低。

表2 各生物碱含量测定结果（%）Tab.2 Results of content determination of various alkaloids （%）

图3 各生物碱含量变化Fig.3 Changes in contents of various alkaloids

2.10 色度值测定 取各批样品，粉碎后过5 号筛，置于色差仪中测定L*、a*、b*，平行3 次，取平均值，计算总色度值E*ab，公式为，结果见表3、图4。由此可知，生延胡索L*、a*、b*、E*ab 范围分别为67.91 ～64.05、5.21 ～ 3.07、41.03 ～ 37.17、78.87～75.19，炮制不及延胡索四者分别为63.83 ～60.09、5.36 ～3.25、39.81 ～34.08、74.32 ～70.39，醋延胡索四者分别为59.61 ～56.82、6.66～4.00、36.51～33.03、29.09 ～66.27，炮制太过延胡索四者分别为60.90 ～54.00、10.72 ～7.84、34.94 ～31.22、70.04 ～63.98； L*（明光度）、b*（黄蓝色度）、E*ab （总色差） 降低，a*（红绿色度）升高，这与炮制过程中饮片由明黄色逐渐转换成黑棕色，而炮制太过后变成棕红色的颜色性状变化相符。

表3 色度值测定结果Tab.3 Results of colorimetric value determination

图4 色度值热图Fig.4 Heatmaps of chromatic values

2.11 相关性分析 将生延胡索-醋延胡索、醋延胡索-炮制太过这2 个阶段中的生物碱含量与色度值导入SPSS 22.0 软件，分析两者相关性，结果见表4。由此可知，在生延胡索-醋延胡索过程中，L*、b*、E*ab 降低时生物碱含量升高，两者呈显著负相关，而a*升高时生物碱含量降低，两者呈显著正相关； 在醋延胡索-炮制太过过程中，L*、b*、E*ab 降低时生物碱含量降低，两者呈显著正相关，而a*升高时生物碱含量降低，两者呈显著负相关，即在生品-醋品炮制过程中，延胡索从黄色逐渐变红褐色，生物碱含量升高； 在醋品-炮制太过品炮制过程中，延胡索红褐色逐渐加深，生物碱含量降低。

表4 生物碱含量与色度值的相关性（n＝3）Tab.4 Correlations between alkaloid contents and chromatic values （n＝3）

3 讨论

延胡索炮制过程是一个实时的、动态的变化过程，要实现质量快速识别，则要求检测手段具有及时、快速、无损，易于操作的优势。色差计内置模拟积分光学系统，通过模拟人眼的视觉系统，可以将光谱数据转量化，分析速度快，可实现在线分析，具有监测饮片炮制过程质量变化的理论基础。

本实验采用HPLC 法测定生物碱含量，比较其含量随时间变化趋势，发现生物碱含量随炮制时间均呈先升高后降低的趋势，在炮制时间为15 min时最高。采用SPSS 软件进行炮制过程生物碱含量与色度值相关性比较，结果显示两者具有显著相关性，在炮制时间为0 ～15 min 时，色度值L*、b*、E*ab 与生物碱含量呈显著负相关，色度值L*、b*、E*ab 值降低，生物碱含量升高； 色度值a*与生物碱含量呈显著正相关，色度值a*升高，生物碱成分含量升高； 在炮制时间为15 ～30 min 时，色度值L*、b*、E*ab 与生物碱含量呈显著正相关，色度值L*、b*、E*ab 降低，生物碱含量降低； 色度值a*与生物碱含量呈显著负相关，色度值a*升高，生物碱含量降低。提示醋延胡索在炮制过程中，颜色由黄转黑，生物碱含量升高，由黑转红时，生物碱含量降低。

本实验在“辨状论质” 的思想指导下，将外观颜色表征量化，并与醋延胡索饮片内在成分含量相结合，使得基于颜色性状的饮片鉴别更加客观，醋延胡索炮制过程更加标准化，为醋延胡索炮制过程的质量控制提供参考。