炆黄精炮制工艺优化及其成分与色泽相关性分析

邓延文，钟凌云，刘 洪，王 硕，卢兴美

（江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004）

黄精味甘，性平，具有补气养脾、健脾润肺益肾的功效，临床常用于脾胃气虚、胃阴不足等症［1］。生品黄精口服有麻舌感及刺喉感［2］，需经炮制才可服用。常见的炮制方法主要有清蒸、酒蒸、九蒸九晒制、炆制等［3-6］。炆制法首载于《肘后备急方》［7］，《建昌帮中药炮制全书》［8］记载：“黄精经炆或蒸制可去其副作用，使药材味厚气香，增强补脾益肾之力； 加酒则补而不腻，并增强补中气，强筋骨之力”。2008 年版《江西省中药炮制规范》［9］亦有收录，但是其仅以黄精不同饮片的外观性状作为区分生、制黄精的手段，且炆黄精古法繁琐，工艺参数不明确，难以保证产品质量。

本实验对黄精炆制加工炮制工艺进行深入探讨，以Box-Behnken 响应曲面法［10-12］结合层次分析法（AHP）、变异系数法优选炆黄精炮制工艺； 并引入色差分析技术，测定炆黄精的色度值，研究其色度与成分的内在变化规律。本实验在保证炆黄精饮片疗效，控制其质量的基础上，精简炆黄精炮制工艺，使炆黄精的生产更加规范，质控更加有效，以期为炆黄精饮片在炮制过程中质量监控提供数据支持，更好规范炆黄精生产工艺。

1 材料

1.1 仪器 SR-62 高品质电脑色差仪（深圳市三恩时科技有限公司）； Waters 2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； 高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）； 电子分析天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； 二两装高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）； 普析通用新世纪紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 多花黄精（批号202103） 由江西继中堂健康科技有限公司提供，经江西中医药大学药学院教授龚千锋老师鉴定为正品。黄酒（批号20210608） 由浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司提供。5-羟甲基糠醛、薯蓣皂苷元、D-无水葡萄糖对照品 （ 批号 CHB-Q-096、CHB-S-094、CHB201122，纯度≥98%） 均购自成都克洛玛生物科技有限公司。蒽酮为分析纯（批号20150906），购自国药集团化学试剂有限公司； 浓硫酸、无水乙醇为分析纯，购自西陇科学股份有限公司； 水为纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备 取生黄精适量，清水洗净后加水浸泡12 h，取出，置入炆药坛中炆制12 h，密闭，焖制12 h，取出，晒干，置于容器中，加入余汁、定量黄酒，拌匀浸润，武火蒸制4 ～6 h，停火，焖制12 h，待表面转黑色时取出，晒至半干，切成斜厚片，晒干，即得。

2.2 多糖含量测定 参考文献［1］ 报道。

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取D-无水葡萄糖对照品3.3 mg，置于10 mL 量瓶中，加水定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取炮制品约0.25 g，加入150 mL 80%乙醇，加热回流提取1 h，滤过，10 mL 80%热乙醇洗涤残渣，重复3 次，收集残渣、滤纸，置于圆底烧瓶中，加热回流提取1 h，滤过，10 mL 热水洗涤残渣、烧瓶4 次，冷却至室温，移至250 mL 量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，加水至2.0 mL，摇匀，放入冰水浴中，缓慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，在冰水浴中放冷，保温10 min，立即取出，再放入冰水浴中冷却10 min，取出，在582 nm 波长处测定吸光度，以0.2% 蒽酮-硫酸溶液为空白对照。以对照品质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归，得方程为A＝32.312X-0.022 （R2＝0.999 5），在0.003 3～0.019 8 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4 方法学考察 按照2020 年版 《中国药典》［1］方法，测得精密度、重复性、稳定性、加样回收率RSD 分别为0.03%、2.69%、2.78%、0.31%，平均加样回收率为97.30%，均符合相关要求。

2.3 5-羟甲基糠醛含量测定 参考文献 ［13］报道。

2.3.1 色谱条件 Diamon-sil-C18（2）色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈 （A） -水（B），梯度洗脱（0 ～8 min，13% A； 8 ～13 min，13% ～20% A； 13 ～18 min，20% ～50% A； 18 ～25 min，50% ～80%A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长284 nm； 进样量10 μL。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取5-羟甲基糠醛对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，得0.238 mg/mL 贮备液，倍比稀释至0.001 19、0.011 9、0.029 75、0.041 65、0.053 55、0.071 4、0.101 15、0.238 mg/mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3.3 供试品溶液制备 精密称取炮制品约2.0 g，加50 mL 50% 乙醇，称定质量，超声（功率500 W，频率40 kHz） 处理1 h，50%乙醇补足减失的质量，摇匀，离心，取上层，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.2” 项下对照品溶液适量，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标 （Y） 进行回归，得方程为Y＝66 026 253.831 2X-248 276.698 7 （R2＝0.999 0），在0.001 19～0.238 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.5 方法学考察 按照2020 年版《中国药典》［1］方法，测得精密度、重复性、稳定性、加样回收率RSD 分别为0.74%、0.47%、0.82%、1.08%，平均加样回收率为98.33%，均符合相关要求。

2.4 醇溶性浸出物测定 参考文献［1］ 报道，精密称取炮制品3 g，加100 mL 稀乙醇，称定质量，静置1 h，水浴回流并维持微沸1 h，冷却后称定质量，稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，量取25 mL 滤液蒸干，在105 ℃下烘干3 h，冷却30 min，称定质量，以干燥品计算醇溶性浸出物含量。

2.5 总皂苷含量测定 参考文献［4，14］ 报道。

2.5.1 对照品溶液制备 精密称取薯蓣皂苷元对照品5.08 mg，置于5 mL 量瓶中，80%乙醇定容，摇匀，即得（该成分质量浓度为1.016 mg/mL）。

2.5.2 供试品溶液制备 称取炮制品1.0 g，加入20 mL 80%乙醇超声提取30 min，共2 次，合并滤液至50 mL 量瓶中，80%无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.3 线性关系考察 精密吸取0.2 mL “2.5.1”项下对照品溶液至1 mL 量瓶中，定容，摇匀，精密吸取0.4 mL，再分别吸取0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于具塞试管中，挥去乙醇，加入0.2 mL 5% 香草醛-冰醋酸溶液，在冰水浴中加入0.8 mL 高氯酸，摇匀，在60 ℃水浴中加热15 min，迅速取出放入冰浴中5 min，加入5 mL 冰醋酸溶液，摇匀，静置5 min，在550 nm 波长处测定吸光度（A）。以对照品质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归，得方程为A＝2.336 1X＋0.163 4 （R2＝0.999 0），在0.008 128～0.711 2 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.5.4 方法学考察 按照2020 年版《中国药典》［1］方法，测得精密度、重复性、稳定性、加样回收率RSD 分别为0.70%、0.41%、0.91%、0.28%，平均加样回收率为96.07%，均符合相关要求。

2.6 水溶性浸出物测定 参考文献［1］ 报道，精密称取炮制品3 g，加100 mL 水，称定质量，静置1 h，水浴回流并维持微沸1 h，冷却，加水补足减失的质量，摇匀，滤过，量取25 mL 滤液蒸干，在105 ℃下烘干3 h，冷却30 min，称定质量，以干燥品计算水溶性浸出物含量。

2.7 外观性状评分

2.7.1 色度值 采用黑白板校正现代色差仪，选择D65 光源、4 mm 孔径、SCE 模式，测定L*、a*、b*，重复3 次，得总色度 （E*ab）。其中，L*表示白-黑轴，白色为“＋”，黑色为“-”； a*表示红-绿轴，红色为“＋”，绿色为“-”； b*表示黄-蓝轴，黄色为“＋”，蓝色为“-”。

2.7.2 方法学考察 按照相关方法，测得精密度、重复性、稳定性RSD 均小于3%，均符合相关要求。

2.8 指标权重确定

2.8.1 变异系数法 根据文献［15-16］ 报道，变异系数计算公式为，其中Vi是第i项指标的变异系数，即标准差系数，σi是第i项指标的标准差，i是第i项指标的平均数。各指标权重计算公式为。结果，多糖、总皂苷、5-羟甲基糠醛、醇溶性浸出物、水溶性浸出物含量权重系数分别为0.152 0、0.267 5、0.544 1、0.024 9、0.011 5。

2.8.2 层次分析法 （AHP） 根据2020 年版《中国药典》 及文献［17-18］ 报道，将各指标划分为4 个层次，分别为多糖含量，权重系数为7；总皂苷、5-羟甲基糠醛含量，权重系数为4； 醇溶性浸出物含量，权重系数为2； 水溶性浸出物含量，权重系数为1。CR 为随机一致性比率，公式为，其中CI 为一致性指标，其数值越小，一致性越大，公式为，小于0.1 表示矩阵符号一致性良好，即权重系数合理有效［19］，结果见表1。

表1 各指标成对比较优先判断矩阵、权重系数Tab.1 Priority judgment matrices and weight coefficients for pair comparison of various indices

2.8.3 变异系数-AHP 复合加权法 根据文献［20-21］ 报道，公式为，其中Wi为变异系数法所得权重，WA为AHP 法所得权重。结果，多糖、总皂苷、5-羟甲基糠醛、醇溶性浸出物、水溶性浸出物含量复合权重分别为0.243 4、0.244 7、0.497 8、0.011 4、0.002 6。

2.9 炮制工艺优化 采用Box-Behnken 响应面法。

取400 g 黄精，以黄酒用量（A）、炆制时间（B）、蒸制时间（C） 为影响因素，每个因素3 个水平，具体见表2，按“2.8.4” 项下方法计算综合评分（Y），测定色度值，结果见表3～4、图1。

图1 生黄精、炆黄精图Fig.1 Images of raw Polygonati Rhizoma and stewed Polygonati Rhizoma

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 试验设计与结果（n＝3）Tab.3 Design and results of tests （n＝3）

表4 色度值测定结果（n＝3）Tab.4 Results of colorimetric value determination（n＝3）

采用DesignExpert 8.06 软件对表3 数据进行二次多元回归拟合，得方程为Y＝30.58-5.67A-9.43B＋0.823 8C＋15.24AB-4.73AC-1.47BC＋22.10A2＋7.17B2-11.90C2，方差分析见表5。由此可知，模型P＜0.05，具有高度显著性； 失拟项P＞0.05，表明模型拟合度良好，无失拟因素存在；各因素影响程度依次为B＞A＞C； 因素B、AB、A2、C2有显著影响（P＜0.05）。响应面分析见图2。

图2 黄酒用量、炆制时间的响应面图Fig.2 Response surface plots for Chinese yellow rice wine dosage and stewing time

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

采用Design-Expert 8.06 软件，得到最优炮制工艺为400 g 生黄精以清水洗净，加水浸泡12 h 后取出，置入炆药坛中炆制8 h，密闭，焖制12 h，取出，晒干，置于容器内，加入余汁、定量黄酒，拌匀浸润，武火蒸5 h 后停火，焖制12 h，待表面转黑色时取出。晒至半干，切成斜厚片，晒干，即得，每100 kg 黄精用15 kg 黄酒。

2.10 相关性分析 将L*、a*、b*与“2.9” 项下指标成分含量进行关联，采用Origin 2021 软件绘制变化趋势图，见图3，再采用GraphPad Prism 8 软件将两者进行皮尔逊相关性分析，结果见表6、图4。由此可知，L*值与多糖含量呈极显著正相关，与总皂苷、5-羟甲基糠醛含量呈显著正相关，表现为L*值越大，多糖、总皂苷、5-羟甲基糠醛含量越高； a*值与醇溶性浸出物含量呈极显著负相关，表现为a*值越大，醇溶性浸出物含量越低，表明多糖、总皂苷、5-羟甲基糠醛含量与黄精色度值存在关联。

图3 指标成分含量、色度值趋势图Fig.3 Trend charts for index component contents and colorimetric values

图4 皮尔逊相关性分析热图Fig.4 Heatmap of Pearson correlation analysis

表6 皮尔逊相关性分析结果Tab.6 Results of Pearson correlation analysis

2.11 逐步回归分析 采用SPSS 21.0 软件中的逐步回归分析，选择色度值作为自变量，判断色度值对指标成分含量的影响程度，结果见表7～8，再转换色度值作为因变量，分析指标成分含量对色度值的影响程度，结果见表9～10。

表7 指标成分含量逐步回归方差分析Tab.7 Analysis of variance for stepwise regression of index component contents

表8 指标成分含量、色度值回归系数Tab.8 Regression coefficients for index component contents and colorimetric values

表9 色度值逐步回归方差分析Tab.9 Analysis of variance for stepwise regression of colorimetric values

表10 色度值、指标成分含量回归系数Tab.10 Regression coefficients for colorimetric values and index component contents

由此可知，多糖含量与L*、b*值有显著相关性，表现为L*值越大，多糖含量越高，b*值越大，多糖含量越低； 总皂苷与L*值有显著相关性，表现为L*值越大，总皂苷含量越高； 醇溶性浸出物含量与a*值有显著相关性，表现为a*值越大，醇溶性浸出物越低； 5-羟甲基糠醛含量与L*、a*值有显著相关性，表现为L*值越大，5-羟甲基糠醛含量越高，a*值越大，5-羟甲基糠醛含量越低。

3 讨论

建昌帮为全国中药炮制的四大流派之一，以擅长传统饮片加工炮制著称，而炆黄精就是其传统特色炮制饮片之一。本实验以2008 年版《江西省中药饮片炮制规范》［9］以及《建昌帮中药传统炮制法》［8］中记载的炆黄精炮制方法为基础，采用Box-Behnken 响应面法，以多糖、总皂苷、5-羟甲基糠醛、醇溶性浸出物、水溶性浸出物等5 种成分含量为评价指标对炆黄精炮制工艺进行优化，得到最优工艺为400 g 生黄精以清水洗净，加水浸泡12 h 后取出，置入炆药坛中炆制8 h，密闭，焖制12 h，取出，晒干，置于容器内，加入余汁、定量黄酒，拌匀浸润，武火蒸5 h 后停火，焖制12 h，待表面转黑色时取出，晒至半干，切成斜厚片，晒干，即得，每100 kg 黄精用15 kg 黄酒。研究表明，优化后的炆黄精工艺，可较大程度保留多糖、总皂苷等有效成分的含量，可以保证炆黄精的药效。其次，优化后炆黄精工艺参数明确具体，与传统工艺相比，缩短了炆制时间，减少了黄酒的用量，有利于工业化大生产和生产成本的降低。

本实验通过色差分析仪测定炆黄精的L*、a*、b*值，通过SPSS 21.0、GraphPad Prism 8.0软件关联炆黄精的化学成分含量和色度，得到皮尔逊相关性以及逐步回归方差结果。结果发现，黄精炮制品的成分与L*、a*值密切相关，L*值越大，多糖、总皂苷、5-羟甲基糠醛含量越高； a*值越大，醇溶性浸出物含量越低。由此可知，炆黄精颜色越黑，其多糖、总皂苷、5-羟甲基糠醛含量就越低。本方法的建立能够为准确判定炆黄精炮制程度提供参考依据。

本实验以多糖、总皂苷、5-羟甲基糠醛、醇溶性浸出物、水溶性浸出物含量为评价指标，利用变异系数法结合层次分析法（AHP） 优选炆黄精炮制工艺，通过成分分析发现炆黄精经炮制后外观色泽与其自身化学成分具有显著相关性，以特定某种颜色来判断黄精炮制程度，揭示古人对炆黄精以“表面转黑色” 为炮制终点的炮制科学内涵。