酒制蜂胶中6 种活性成分体内药动学研究及其代谢产物鉴定

陈 靖，柴 玲，赵夏荫

（1.常德职业技术学院，湖南 常德 415000； 2.广西壮族自治区中医药研究院，广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022； 3.中国中药控股有限公司，广东 佛山 528000）

蜂胶为蜜蜂科昆虫意大利蜂ApismelliferaL.工蜂采集的植物树脂与其上额腺、蜡腺等分泌物混合形成的具有黏性的固体胶状物［1］，酒制蜂胶为该药材经粉碎、乙醇浸泡提取、干燥后的炮制品，临床上内治体虚早衰、高脂血症、消渴，外治皮肤皲裂、烧烫伤［1］。蜂胶中含有黄酮、酚酸、萜烯酸、糖类、氨基酸等多种成分［2-5］，以黄酮、酚酸为主，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抗肿瘤等生物活性［5-8］。

目前，国内外学者关于蜂胶的研究大多为功能成分、生物活性，鲜有涉及药动学方面［9-10］。乔松素、白杨素、高良姜素、对香豆酸、山柰酚、柚皮素为蜂胶中重要的黄酮、酚酸类物质［10］，但其药动学、代谢产物尚不明确，故阐明它们在体内的代谢规律、鉴定其代谢产物对揭示蜂胶药效物质基础具有重要意义。

超高效液相与高分辨质谱联用技术具有良好的定量与定性能力［11］，可实现入血成分的快速识别、解析，已成为入血成分研究的首选方法［12］。本实验采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱 （UPLC-Q Exactive Orbitrap MS） 法测定酒制蜂胶中乔松素、白杨素、高良姜素、对香豆酸、山柰酚、柚皮素的血药浓度，开展体内药动学分析，并对其代谢产物进行鉴定，以期为该炮制品药效物质基础、作用机制的进一步研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Q-Exactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统、UltiMate 3000 超快速高效液相色谱系统（美国热电公司）； Milli-Q 纯水仪（美国密理博公司）； 艾本德5810R 真空浓缩仪（德国艾本德公司）； KQ2200DV 数控声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司）； ME55 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试剂与药物 乔松素（批号PCS0734）、白杨素（批号PCS0041）、高良姜素（批号PCS0429）、对香豆酸（批号PCS0296）、山姜素 （批号PCS0819）、山柰酚 （批号PCS0796）、柚皮素 （批号PCS0914）、氯霉素 （批号PCS220411） 对照品均购自成都植生化纯生物技术有限公司，纯度≥98%。酒制蜂胶（批号220301） 购自湖南一方天江药业有限公司，UPLC-MS 法测得乔松素、白杨素、高良姜素、对香豆酸、山柰酚、柚皮素含量分别为16.97、41.28、35.21、4.672、3.135、21.73 mg/g （未检测到氯霉素）。聚乙二醇400 （上海阿拉丁生物试剂有限公司）。乙腈、乙醇、甲酸均为色谱纯（德国默克公司）。

1.3 动物 雌性SD 大鼠，SPF 级，体质量（270±10） g，购自广西医科大学动物实验中心，动物生产许可证号SCXK （桂） 2020-0003，饲养温度20 ～25 ℃，相对湿度40% ～55%。

2 方法

2.1 UPLC-Q Exactive Orbitrap MS 分析条件

2.1.1 色谱 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流动相0.1% 甲酸（A） -甲醇（B），梯度洗脱（0～2 min，5%B； 2～13 min，5% ～95%B； 13 ～14 min，95% ～100% B； 14 ～16 min，100% B； 16 ～16.1 min，100% ～5% B； 16.1 ～19 min，5% B）； 体积流量0.3 mL/min； 柱温30 ℃； 自动进样器温度4 ℃； 进样量2 μL。

2.1.2 质谱 加热型电喷雾离子源（HESI），正负离子扫描； 传输毛细管温度320 ℃； 鞘气体积流量35 psi （1 psi＝6.895 kPa）； 辅助气体积流量10 psi，温度350 ℃； 扫描模式Full MS/dd-MS2，范围m/z70 ～1 050； 一、二级扫描分辨率70 000、17 500； 碰撞气高纯氮气。各活性成分、内标质谱扫描模式均为负离子模式（HESI-），分子式、母离子m/z分别为C15H12O4、255.065 18 ［M-H］-（乔松素），C15H10O4、253.049 53 ［M-H］-（白杨素），C15H10O5、269.044 44 ［M-H］-（高良姜素），C9H8O3、163.038 97［M-H］-（对香豆酸），C15H10O6、285.039 36 ［M-H］-（山柰酚），C15H12O5、271.060 09 ［M-H］-（柚皮素），C11H12Cl2N2O5、321.003 95 ［M-H］-（内标氯霉素）。

2.2 分组、给药及采血 12 只大鼠适应性喂养1 周后，随机分为空白组和给药组，禁食（自由饮水） 12 h 后，空白组灌胃给予20% 乙醇-50% PEG400 混合液，给药组按1.0 g/kg剂量灌胃给予20%乙醇-50%PEG400 溶解的酒制蜂胶混悬液，于0.033、0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、9、12、24、36 h 眼眶静脉丛采血各约200 μL，置于EP 管中（预涂0.1% 肝素钠抗凝液10 μL），4 ℃、6 000 r/min 离心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.3 对照品、内标溶液制备 精密称取乔松素、白杨素、高良姜素、对香豆酸、山柰酚、柚皮素、氯霉素（内标）对照品适量，甲醇溶解并定容，制成质量浓度1.0 mg/mL的贮备液，置于-20 ℃冰箱中保存，精密量取适量（氯霉素除外），甲醇制成10.0 μg/mL 溶液，再依次稀释至系列质量浓度（乔松素、白杨素均分别为0.5、1、2、4、10、20、50、100、200 μg/L，高良姜素分别为0.5、1、2、4、10、20、50、100、250 μg/L，山柰酚分别为0.5、1、2、4、10、20、50、100、150 μg/L，对香豆酸分别为10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、8 000 μg/L，柚皮素分别为2、4、10、20、50、100、200、250、500 μg/L），即得对照品溶液。再用甲醇将氯霉素贮备液稀释至1.0 μg/mL，即得内标溶液。

2.4 血浆样品处理 吸取血浆样品、甲醇各50 μL，加入内标溶液10 μL、乙腈（含0.1%甲酸） 800 μL，涡旋混匀2 min，静置2 min，13 000 r/min 离心10 min，移取上清液至干净EP 管中，离心浓缩至干，50 μL 甲醇复溶，13 000 r/min 离心1 min，取上清液，即得。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性试验 取空白血浆、空白血浆＋对照品、灌胃给药24 h 后血浆样品适量，按“2.4” 项下方法处理，在“2.1” 项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，血浆中杂质及其他内源性物质对各活性成分、内标无干扰，表明该方法满足生物样品的专属性要求。

图1 各活性成分UPLC-Q Exactive Orbitrap MS 图

3.1.2 线性关系考察 吸取空白血浆、对照品溶液各50 μL，加入内标溶液10 μL、乙腈（含0.1%甲酸） 800 μL，按“2.4” 项下方法处理，在“2.1” 项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），对照品、内标峰面积比值为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各活性成分在各自范围内线性关系良好（R2＞0.99）。

表1 各活性成分线性关系

3.1.3 精密度、准确度试验 吸取空白血浆50 μL，加入不同质量浓度对照品溶液，得到低、中、高质量浓度的质控样品，按“2.4” 项下方法处理，在“2.1” 项条件下进样测定，结果见表2。由此可知，各活性成分日内、日间准确度为85.10% ～112.15%，精密度RSD 均低于10%，满足生物样品分析要求。

表2 各活性成分精密度、准确度试验结果（n＝6）

3.1.4 提取回收率、基质效应试验 取低、中、高质量浓度质控样品各6 份，按“2.4” 项下方法处理，在“2.1”项条件下进样测定，记录化合物、内标峰面积比值； 另取空白血浆适量，同法操作，记录两者比值； 另取甲醇代替空白血浆，同法操作，记录两者比值，按文献［13］ 报道计算提取回收率、基质效应，结果见表2。由此可知，各活性成分提取回收率为87.07% ～110.97%，基质效应为98.60% ～114.43%，满足生物样品分析要求。

3.1.5 稳定性试验 取低、中、高质量浓度质控样品各6份，分别考察室温放置2 h、自动进样器中12 h、反复冻融3 次、-80 ℃下放置21 d 的稳定性［14］，结果见表3。由此可知，各活性成分准确度为85.44% ～113.82%，RSD 均小于11%，满足生物样品分析要求。

表3 各活性成分稳定性试验结果（n＝6）

3.2 体内药动学研究 血药浓度-时间曲线见图2，再采用WinNonlin 软件中的非房室模型计算主要药动学参数，结果见表4。由此可知，各活性成分Tmax均在0.30 h 以内，表明其吸收均较快；t1/2z依次为山柰酚＜对香豆酸＜乔松素＜高良姜素＜柚皮素＜白杨素； 灌胃给药后12、24、36 h，血浆中均未检测到山柰酚； 大多数活性成分血药浓度-时间曲线存在“双峰” 现象。

图2 各活性成分血药浓度-时间曲线（±s，n＝6）

表4 各活性成分主要药动学参数（±s，n＝6）

表4 各活性成分主要药动学参数（±s，n＝6）

活性成分Tmax/hCmax/（ng·mL-1）AUC0 ～t/（ng·mL-1·h） AUC0～∞/（ng·mL-1·h）t1/2z/hMRT0 ～t/h乔松素0.25±0.00124.69±9.93179.52±24.28263.26±56.817.24±3.7913.21±1.68白杨素0.30±0.12138.30±13.53277.30±83.37328.35±117.3011.96±5.9710.57±3.47高良姜素0.25±0.00187.51±17.74430.93±153.07406.15±78.289.73±2.7013.49±5.19对香豆酸0.27±0.154 894.99±836.8021 778.14±858.4522 329.55±749.444.91±0.957.91±0.86山柰酚0.17±0.10102.65±30.7659.76±12.0772.21±9.093.39±1.341.88±0.78柚皮素0.12±0.07182.81±33.48778.35±143.65900.52±149.7410.77±1.6411.35±0.43

3.3 代谢产物鉴定 6 种活性成分中，除了对香豆酸为酚酸类外，其他5 种均为黄酮类。前期报道，上述成分代谢途径包括Ⅰ相代谢反应（羟基化、去羟基化、还原）、Ⅱ相代谢反应（甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化）［15］。

将“2.2” 项下不同时间点采集的血浆等体积混合，按“2.4” 项下方法处理，在“2.1” 项条件下进样测定，总离子流图见图3，并且发现15 种代谢产物，具体见表5。由此可知，各活性成分均发生了I、Ⅱ相代谢反应，以后者为主。

图3 大鼠血浆UPLC-Q Exactive Orbitrap MS 总离子流图

表5 各活性成分代谢产物

以乔松素为例。M1 在正离子模式下产生准分子离子峰m/z433.110 05 ［M＋H］＋，其碎片离子m/z257.079 22 与母离子分子量相差176，为后者脱去一分子葡萄糖醛酸所得；m/z153.017 27、131.048 46 与乔松素对照品在正离子模式下的一致，推测可能为该成分发生葡萄糖醛酸化的代谢产物，即乔松素葡萄糖醛酸，分子式为C21H20O10。M2 在负离子模式下产生准分子离子峰m/z335.022 09 ［M＋H］-，其碎片离子m/z255.065 14 与母离子分子量相差80，为后者脱掉一分子硫酸酯所得，推测可能为乔松素发生硫酸酯化的代谢产物，即乔松素硫酸酯，分子式为C15H12SO7。

4 讨论

体内药动学研究结果表明，酒制蜂胶乔松素、白杨素、高良姜素、山柰酚、柚皮素、对香豆酸达峰时间均不超过0.3 h，表明它们在大鼠体内的吸收速度较快［16］，其中对香豆酸体内暴露量远大于其他成分，提示该成分主要以原型形式吸收入血，而其他5 种黄酮的原型成分最大峰浓度均不高。再鉴定上述6 种成分的代谢产物，发现它们发生了Ⅰ、Ⅱ相代谢反应，推测一旦摄入体内后可能经历广泛的系统前代谢，在肠道、肝脏中通过甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等代谢途径，其原型以极低浓度在体内定位［17］，而结合型代谢产物在生理活动中往往起着重要作用［18］。另外，高良姜素葡萄糖醛酸化代谢出现了2 种同分异构体的代谢物，表明经肝脏代谢时葡萄糖醛酸化主要发生在3、7 位羟基上［19］，所鉴定到的高良姜素葡萄糖醛酸A、B 根据其极性不同，推测可能分别为高良姜素-3-Oβ-D-葡萄糖醛酸、高良姜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸［20］。同时，共鉴定出相关代谢产物15 个，主要为Ⅱ相代谢物，并且酒制蜂胶入血成分的药效物质形式还有待于进一步研究，其药效作用机制尚需继续在动物、细胞、分子水平进行验证。