基于GEO 数据库及网络药理学探讨六郁汤辅助治疗重度抑郁症的作用机制

谢淑君，袁海静，范婷婷，杨宏光

（广州中医药大学第三附属医院血液肿瘤科，广东 广州 510378）

重度抑郁症（major depressive disorder，MDD）是一种复杂的、多因素的、高度异质性的精神疾病。据统计，我国成人抑郁障碍终生患病率高达6.8%[1]，其中重度抑郁症在青少年中的发病率高达4.8%[2]，MDD 因高患病率和致残率，给社会和家庭带来沉重负担。目前抗抑郁药仍是重度抑郁症的一线治疗手段，但起效较慢且效果有限[3]。中医药可通过多途径、多靶点、多层次发挥抗抑郁作用，在抑郁症的治疗上具有不可替代的独特优势[4]。六郁汤出自《医学正传》，由半夏、陈皮、苍术、川芎、茯苓、栀子、香附、炙甘草、砂仁组成。研究证据显示，六郁汤具有抗抑郁[5，6]、改善抗精神病药所致的代谢综合征等作用[7]，但其具体作用机制尚不明确。本研究联合GEO 数据库及网络药理学和分子对接的方法探讨六郁汤辅助治疗重度抑郁症的潜在机制，以期为重度抑郁症的治疗用药提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 六郁汤活性成分及靶点 筛选基本药物的ADME 模型，设置“口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18”为筛选指标[8]，分别以“陈皮、半夏、苍术、川芎、茯苓、栀子、香附、甘草、砂仁”为检索词，检索中药系统药理分析平台数据库（TCMSP，https://tcmsp-e.com/），获取六郁汤主要活性成分及对应靶点；运用Perl 脚本（https://www.perl.org/）结合UniProtKB 数据库（https://www.uniprot.org/）中已验证的人类基因对成分靶点进行标准化命名。

1.2 MDD 潜在作用靶点筛选 利用GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“Major depressive disorder ”为检索词，获取序列号为GSE76826 的基因芯片矩阵和注释文件。此芯片为32 个血液样本的基因表达谱数据，其中20 个来自MDD 患者（试验组），12 个来自健康人群（对照组）。使用R 语言limma 对芯片数据进行分析获取MDD患者与健康人的差异表达基因（|logFC|＞0.05，P＜0.05）。按照P值筛选前20 个差异基因绘制基因热图和火山图。以“Major depressive disorder”为检索词，逐一检索OMIM 数据库（https://www.omim.org/）、TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）、Genecards 数据 库（http://www.genecards.org）、Durgbank 数据库（https://go.drugbank.com/）、PharmGKB 数据库（https://www.pharmgkb.org），获取MDD 相关靶点基因。

1.3 绘制疾病靶点韦恩图 将六郁汤活性成份靶点、GEO 差异基因、MDD 相关靶点基因去除重复值后，通过Venny2.1 在线工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），获得上述靶基因交集的韦恩图。

1.4 六郁汤治疗MDD“活性成分-靶点基因”网络关系构建 运用Perl 语言将“1.3”项获得的交集基因与“1.1”项获得的成分靶点基因相互映射，获得交集基因相对应的活性成分；借助Cytoscape3.9.0 软件进行可视化分析，绘制出六郁汤治疗MDD 的“活性成分-疾病靶点”网络图。

1.5 PPI 蛋白互作网络的构建及可视化分析 使用STRING 数据库（https://cn.string-db.org/，Version:11.5），构建“1.3”项下的交集基因PPI 网络。选择“Homo sapiens”，设置最低互动分数选择为0.400 导出TSV 文件。再利用Cytoscape3.9.0 插件cytoNCA 对PPI 网络进行拓扑分析，获得PPI 核心子网络。

1.6 六郁汤与MDD 的GO 功能和KEGG 信号通路分析 运用R 软件安装Bioconductor 平台(https://www.bioconductor.org/，Version3.14）数据包org.Hs.eg.db 对基因进行编码，将“1.3”项获得的交集靶基因转换成entrezID；使用R 语言进行交集靶点基因的G和KEGG 富集分析，设置阈值校正P＜0.05，并绘制GO 和KEGG 的气泡图。

1.7 分子对接 从PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载活性成分2D 结构文件，保存为“SDF”格式，导入Chem3D 20.0 软件进行能量最小化处理，输出为mol2 格式文件，作为小分子配体。根据分子模拟建模靶标结构的选择原则，以“Homo sapiens”“X -RAY DIFFRACTION”、REFINEMENT RESOLUTION（Å）≤2.5”为筛选标准[11]，从PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）中下载度值排名前5 的核心靶点对应基因ID 的PDB 格式文件。利用PyMOL 软件对对接受体进行处理后，再借助AutoDock Tools1.5.7 软件进行加氢处理，保存为pdbqt 格式文件。使用AutoDock Vina1.1.2 软件完成分子对接，以对接结合能并作为对接评价指标。使用PyMOL 软件对结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 六郁汤活性成分及作用靶点的筛选 从TCMSP数据库中获得六郁汤活性成分184 个；其中半夏活性成分13 个、苍术9 个、川芎7 个、茯苓35 个、陈皮5 个、甘草92 个、砂仁10 个、香附18 个、栀子15 个。删除重复，最终获得168 种活性成分。将活性成分对应靶点与UniProtKB 数据库中已认证的人类基因进行映射，删除重复，最终得到244 个靶点基因。

2.2 MDD 潜在作用靶点 借助R 语言对GSE76826芯片数据分析，以|logFC|＞0.05，P＜0.05 为筛选标准，获得健康受试者和MDD 患者差异表达基因808 个（上调基因272 个，下调基因536 个），差异基因火山图见图1，表达谱见图2。以“Major depressive disorder”为检索词分别在GeneCard、PharmGKB、DrugBank、OMIM、TTD 5 个数据库中检索得MDD 靶点基因1268、138、104、229、57 个，合并去重后共1494 个。

图1 MDD 患者GEO 差异基因火山图

图2 MDD 患者GEO 差异基因表达谱

2.3 六郁汤与MDD 靶点基因韦恩图 将244 个六郁汤活性成分对应靶标基因、808 个MDD 差异基因、1494 个MDD 靶点基因上传至Venny2.1 在线软件，共获取117 个交集靶点基因，见图3。

图3 六郁汤与MDD 靶点韦恩图

2.4 “活性成分-药物靶点”网络构建 将117 个交集靶标基因及其对应的活性成分导入Cytoscape3.9.0软件构建“活性成分-MDD 靶点”可视化网络图，得到238 个节点，1134 条，见图4。借助Analyze Network插件分析得到Degree（DC）值，并根据Degree 值进行排序，其中排名前5 的活性成分：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、7-甲氧基-2 甲基异黄酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、四氢帕马丁（Hyndarin）。

图4 六郁汤-MDD“活性成分-药物靶点”网络图

2.5 PPI 网络构建及核心靶点筛选 将117 个六郁汤与MDD 共同靶点基因，导入String11.5 数据库，构建PPI 网络图见图5，得到117 个节点，1591 条边。使用Cytoscape 软件中的cytoNCA 插件对PPI 的tsv 文件进行拓扑分析，选择参数均大于BC、DC、CC、EC、LAC、NC 中位值的基因作为核心靶点，依此为标准，进行2 次筛选，最终得16 个核心靶点基因。其中AKT1、IL1B、TP53、CASP3、MMP9 为度值排名前5 的靶点基因，见表1。

表1 核心靶点拓扑信息表

图5 PPI 网络图及核心靶点筛选图

2.6 GO 分析和KEGG 分析 在2372 条GO 功能富集条目中，涉及外源刺激反应、体液调节、脂多糖反应、细菌来源分子反应等生物过程（BP）；其中细胞组分CC 主要包括膜筏、膜微区、突触后膜等；分子功能MF 主要涉及G 蛋白偶联胺受体活性、突触后、神经递质受体活性等。根据校正后P值列举各类排名前10 的生物学功能条目，见图6。

图6 GO 功能富集分析气泡图

164 条KEGG 通路富集主要涉及脂质与动脉粥样硬化、神经活性配体-受体相互作用、糖尿病并发症中的AGE-RAGEPI3K-Akt 信号通路、白细胞介素17（IL-17）等信号通路等。排名前30 位KEGG 通路输出气泡图及KEGG 富集通路靶点网络图，见图7、图8。

图7 KEGG 富集分析气泡图

图8 KEGG 富集通路靶点网络图（续）

图8 KEGG 富集通路靶点网络图

2.7 分子对接 度值排名前5 的核心靶点AKT1、IL1B、TP53、CASP3、MMP 与对应的活性成分分子对接结果见图9。核心靶点与对应活性成分的结合自由能均≤-6 kcal/mol，构象稳定，相互作用较强。其中度值排名第1 的槲皮素与5 个核心靶点均有很好的结合活性，结合能均≤-7 kcal/mol。MMP9 与度值排名第2 的木犀草素结合活性最好，氢键结合能为-11.1 kcal/mol。选择与槲皮素及木犀草素均有作用的靶点（AKT1、TP53、CASP3、MMP9）的对热图予以展示，见图10。

图9 分子对接热图

图10 分子对接图

3 讨论

重度抑郁症属于中医“郁证”范畴，元代著名医家朱丹溪基于“凡郁皆在中焦”理论，首倡“气、血、痰、火、湿、食”六郁学说，并独创名方“六郁汤”治诸郁[8]。六郁汤是治诸郁的基本方，方中苍术、川芎总解诸郁；川芎，治血郁；香附行气解郁，治气郁；半夏、陈皮理气化痰，治痰郁；茯苓、苍术，燥湿运脾，兼治湿郁；砂仁化湿开胃，宣畅中焦，治食郁；栀子清热泻火，治火郁；甘草调和诸药。临床研究显示[5]，六郁汤可有效改善抑郁症状，但目前相关机制研究较少。

本研究结果显示，在六郁汤168 中有效成分中，槲皮素、木犀草素、山奈酚等为作用靶点最多的核心有效成分。槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、山奈酚（Kaempferol）均属于天然黄酮类化合物，均具有抗炎、抗氧化、神经保护及抗抑郁作用[9，10]，也是香附、栀子、甘草的主要活性成分。Adeoluwa OA 等[10]研究发现，槲皮素通过小胶质细胞NLRP3/NF-κB/iNOS 信号通路抑制神经炎症，消除脂多糖诱导的抑郁样症状。木犀草素的抗抑郁活性与抑制内质网（ER）应激[11]、调节神经炎症和自噬[12，13]有关。山奈酚可显著抑制CUMS 抑郁症模型大鼠海马区神经元凋亡，并降低凋亡相关蛋白Bax 和Caspase-3 的表达等发挥神经保护作用；同时还能显著抑制IL-1β、TNF 等炎性因子表达，抑制神经炎症的发生[14]。六郁汤中的其他有效成分如汉黄芩素（Wogonin）、黄芩甙元（baicalein）等均有抗抑郁活性，汉黄芩素被认为可用于抑郁治疗的新的有效和可逆的MAO-A 抑制剂[15]黄芩苷可通过抑制toll 样受体4（TLR4）的表达来改善抑郁小鼠神经炎症诱导的抑郁症状，其机制可能与调控PI3K/AKT/FoxO1 通路有关[16]。

AKT1、IL1B、TP53、CASP3、MMP9 等为六郁 汤治疗MDD 的核心靶点基因。AKT1 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）的重要亚型，其多态性与抑郁患者的抑郁严重程度、自杀倾向、抗抑郁治疗反应、认知功能损伤等密切相关[17，18]。促炎性细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）的多效性已被认为与抑郁症的发病机制和病因有关[19，20]。IL1B 基因位点rs16944、rs116343 多态性与抑郁症发病及不同治疗预后反应具有密切关联[21]。TP53 又称为抑癌基因、促凋亡蛋白，广泛参与响应不同形式的急性损伤和神经系统疾病的神经元死亡。基质金属蛋白酶-9（MMP9）被认为是重度抑郁症的主要标志物之一，可通过调节炎症反应、参与突触形成及突触可塑性等途径[22，23]，发挥抗抑郁作用。Caspase-3 蛋白是Caspases 家族中介导细胞凋亡的核心蛋白酶，在凋亡过程中起决定性的调控作用。海马神经元细胞凋亡参与抑郁病程[24]。慢性轻度压力（CMS）动物模型表明[25]，抑郁样行为伴有神经炎症、神经元损伤、细胞凋亡和海马神经发生减少。结合分子对接结果，槲皮素与上述靶点均有较好的结合活性，且槲皮素、木犀草素与MMP9靶点作用最强。由此可推测，六郁汤槲皮素、木犀草素为六郁汤抗抑郁的核心成分，且主要靶向氧化应激、炎症、凋亡等相关靶点发挥抗抑郁作用。

GO 功能富集的生物过程（BP）主要涉及外源刺激反应、脂多糖反应、细菌来源分子反应等，与炎症反应相关，此外，脂质与动脉粥样硬化、神经活性配体-受体相互作用、AGE-RAGE 信号通路、PI3K-Akt等信号通路为显著富集的通路。Miao G 等[26]发现，脂类代谢改变可能通过增加酸性鞘磷脂酶和磷酸脂酶的活性，干扰神经递质和膜信号，增强炎症，氧化应激和脂质过氧化作用，和/或影响脂滴或膜形成中的能量储存，从而影响抑郁症。AGE-RAGE 信号通路可激活PI3K/Akt、MAPK/ERK 和NF-κB 等多个细胞内信号通路，促进炎症因子、趋化因子和粘附分子的表达增加，并诱导氧化应激[27]。PI3K/Akt（磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B）信号通路是治疗抑郁症的重要级联信号通路，也是调节机体内细胞存活、分化及凋亡的重要信号通路之一，也是多种抗抑郁中药的靶点通路[28]。抗抑郁中药可以通过调节PI3K/Akt信号通路进而影响上述过程，从而发挥抗抑郁作用。另外，炎性细胞因子可影响氧化应激、神经递质代谢、神经内分泌等多个下游生物学效应，促进抑郁症的发生及发展。IL-17[29]、TNF-α[30]等炎症相关信号通路也在抑郁症的病理生理学和抗抑郁治疗机制中发挥着不可或缺的作用，六郁汤也可以靶向上述炎症相关信号通路发挥抗抑郁作用。

综上所述，六郁汤可能通过调控AKT1、IL1B、TP53、CASP3、MMP9 等关键靶点，介导脂质与动脉粥样硬化、AGE-RAGE 信号通路、神经活性配体-受体相互作用、PI3K/Akt、IL-17 等信号通路，通过抗炎、抗氧化应激、调节突触形成、抑制神经元凋亡等途径，发挥抗抑郁作用，具有多成分、多靶点、多通路等协同作用机制特点。但本研究仅从微观角度探讨了六郁汤抗MDD 的作用机制，研究结果仍有待进一步的临床和实验验证，使其临床应用更具有指导意义。