嗅三针对血管性痴呆大鼠海马CA1区损伤及Keap1/Nrf2/ARE信号通路关键蛋白的影响

李 杰,王 强,2,王 渊,刘隽阳,郭 婕,李 华,牛文民,张安仁

(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046;2.陕西省针药结合重点实验室,陕西 咸阳 712046;3.同济大学附属上海市第四人民医院,上海 200434)

血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是由各种血管因素发生病理变化引起的脑组织损害,临床常表现为认知、学习、记忆等功能障碍,给患者的日常生活、工作带来极大不便[1]。本团队在多年的研究中发现,嗅三针对痴呆的症状有较好改善作用,而其作用机制需进一步阐明,故开展本次研究工作。本次以VD模型大鼠为研究对象,从VD早期出现的氧化应激着手,围绕VD早期出现的抗氧化kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)/核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 ,Nrf2) /抗氧化反应元件(AU-rich element,ARE)信号通路展开研究,探索嗅三针治疗VD的分子机制,为治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂与仪器:戊巴比妥钠(批号57432),伊红、苏木(批号c0109、c0107),二甲苯(批号534056),中性树胶(批号YSQN41)。RIPA裂解液、蛋白Marker、Bradford蛋白浓度试剂盒(上海碧云天公司),PVDF膜(Immobilon-PSQ公司),Nrf2抗体(批号AF0639),HO-1抗体(批号AF5383),NQO1抗体(批号DF6437),山羊抗兔(批号GB21303),ML385(批号S8790)。华佗针、韩式电针仪(苏州医疗用品有限公司),显微镜、全能型成像分析系统、PH计(BIO-RAD公司),灰度分析软件(Alpha Innotech公司),冰冻切片机(HM525 NX UV公司),正置荧光显微镜(Thermo Scientific公司)。

1.1.2 实验动物:选择雄性SD大鼠,平均体重(200±20)g,购自西安交通大学动物实验中心,饲养于陕西中医药大学动物实验中心动物房。饲养房间室内温度22～24 ℃,湿度为60%～70%,光暗周期为12 h,设置自动亮灯时间段为08:00～20:00、灭灯20:00～8:00,通风系统保持良好。待大鼠到达实验室,适应性喂养1周后,开展后续实验。定期喂养,及时更换垫料,操作中轻柔抓取和触摸,使大鼠能够较早适应抓取操作。采用Morris水迷宫实验检测,剔除不合格大鼠,将符合条件的大鼠随机分为假手术组、模型组、嗅三针组、抑制剂组,每组15只。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法:大鼠术前禁食12 h,禁水4 h,根据体重选用适量的2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。待麻醉后,固定大鼠,消毒,沿颈部中线切开皮肤,用镊子撕开皮下组织,运用玻璃分针分离双侧颈总动脉、周围神经,暴露双颈总动脉。用玻璃分针挑起颈总动脉,分离附着的神经及膜组织,两端结扎,从结扎处中间剪断颈总动脉,另一侧运用同样操作方法,0.9%氯化钠溶液冲洗伤口,用头孢青霉素冲洗处理,缝合皮肤[2]。VD主要表现为认知功能降低,将认知学习、空间记忆、空间识别作为检测指标,采用Morris水迷宫测试方法,记录大鼠逃避潜伏期,并与假手术组做比较,计算其差值占该鼠逃避潜伏期的比例,比值大于20%为痴呆[3-4]。

1.2.2 针刺干预方法:针刺干预采用的是嗅三针带电治疗,简称为“嗅三针”。嗅三针的穴位为双侧迎香、印堂,根据《实验针灸学》[5]大鼠穴位定位图谱,迎香穴位于大鼠鼻孔外侧上端,有毛与无毛交界处,印堂穴位于大鼠两眼眶上缘中点连线与正中线交点。电针方法:迎香穴向内上方斜刺2～3 mm,印堂向鼻根平刺2～3 mm;正极接印堂,负极接一侧迎香,刺激10 min,负极换接另一侧迎香,刺激10 min。刺激参数:疏密波,频率为2/15 Hz,强度为1 mA,1次/d,5 d为1个疗程,休息2 d,共4个疗程。运用特制的大鼠固定袋、固定架固定实验大鼠,假手术组大鼠在相同时间采用相同程度的捉抓刺激,运用固定架固定20 min。

1.2.3 ML385配置及应用方法:ML385为Nrf2的靶向抑制剂,配置时称取ML385粉末,将其溶解在纯DMSO中配制成原液(即母液),母液浓度为40 mg/ml,适当加入PBS稀释成5%溶液,在37 ℃水浴锅中加热至完全溶解。按照体积比加入其他溶剂,具体配方为:5%母液、40%的PEG300、5%的Tween80、50%的PBS;配置工作液浓度2 mg/ml。将配置好的ML385腹腔注射于大鼠,用量30 mg/(kg·d)。

1.2.4 各组干预方法:假手术组大鼠打开皮肤,暴露双侧颈总动脉,缝合;模型组大鼠采用双侧颈总动脉结扎术制备VD模型;嗅三针组大鼠在VD造模基础上,加嗅三针带电治疗,具体见1.2.2;抑制剂组大鼠在VD造模基础上,加抑制剂ML385,具体用法见1.2.3。

1.2.5 Morris水迷宫实验检测大鼠行为学:定位航行实验历时5 d,正式测试前1天的测试为大鼠适应性训练,使大鼠熟悉水迷宫房间环境,大鼠在水迷宫中游泳探索寻找水下隐匿目标平台,以水池周围的空间环境,池壁上不同形状、颜色标识物作为参照对象,对迷宫水下目标平台空间位置做一对比识别记忆,大鼠下水后,快速找到目标平台,记录找到并登上目标平台的时间,即逃避潜伏期。以大鼠逃避潜伏期评价不同组别大鼠学习和空间记忆能力。

1.2.6 HE染色大鼠海马CA1区组织:各组大鼠干预疗程完成后,取材,固定,包埋,切片,经过脱蜡,染色,脱水,封片,拍照,显微镜下观察并拍照采集图像。

1.2.7 Western blotting检测大鼠海马组织HO-1、NQO1蛋白表达:组织总蛋白提取、测定和变性,电泳,转膜,免疫反应,化学发光。

1.2.8 免疫荧光法检测海马CA1区Nrf2活化情况:将组织切片,脱蜡,抗原修复,封闭,加抗体,DAPI复染,淬灭,显微镜下观察并拍照采集图像。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学表现比较 假手术组大鼠状况良好,反应灵敏,毛发整齐润滑,进食、进水均正常。模型组、抑制剂组大鼠造模完成后3 d内状况较差,反应迟钝,行动缓慢,毛发无光泽,进食、进水较少,3 d后状态逐渐恢复,行动逐渐敏捷。嗅三针组大鼠造模完成后3 d内状况较差,似于模型组,15 d后与抑制剂组、模型组大鼠比较,精神状态明显较好。

2.2 各组大鼠定位航行、空间探索轨迹比较 见图1、2。各组大鼠在Morris水迷宫实验中的逃避潜伏期、空间探索轨迹不同。模型组、抑制剂组大鼠寻找目标平台游泳的距离大于假手术组、嗅三针组;空间探索试验结果中,假手术组、嗅三针组穿越平台区次数、平台区游泳距离明显多于模型组、抑制剂组。

图2 各组大鼠空间探索轨迹比较

2.3 各组大鼠海马区病理形态学比较 见图3。显微镜下观察海马CA1区细胞,假手术组CA1区组织形态结构清晰,细胞排列整齐,轮廓清晰;模型组细胞排列紊乱,间隙增大,坏死数量增多,核固缩增多;与模型组比较,嗅三针组细胞形态结构清晰,排列较整齐,核仁清晰;与嗅三针组比较,抑制剂组细胞排列不齐,数目减少,分布不均,核固缩增多,边界不清晰。

2.4 各组大鼠 Nrf2蛋白表达比较 见图4。显微镜下观察大鼠海马CA1区细胞Nrf2蛋白表达情况,假手术组有少量表达,模型组、抑制剂组有部分阳性表达,嗅三针组有强阳性表达。对各组图像进行对比分析,与假手术组比较,模型组海马CA1区Nrf2蛋白增加;与模型组相比,嗅三针组Nrf2蛋白增加;与抑制剂组相比,嗅三针组Nrf2蛋白表达增加。

2.5 各组大鼠海马组织HO-1、NQO1蛋白表达比较 见表1(图5)。假手术组大鼠海马组织HO-1、NQO1有一定的表达,而模型组表达高于假手术组,这是机体自我保护作用。嗅三针组大鼠海马组织HO-1、NQO1表达高于模型组、抑制剂组,这是在针刺干预下保护机制的增强表现。

表1 各组大鼠HO-1、NQO1蛋白相对表达量比较

图5 各组大鼠海马组织HO-1、NQO1蛋白电泳图

3 讨 论

《素问·四气调神论篇》:“是故圣人不治已病治未病,不治已乱治未乱,此之谓也”,明确提出了要把疾病控制在萌芽阶段,阻止或延缓疾病的发展进程,即治未病理念[6-7]。本团队学术带头人牛文民、刘智斌教授多年来致力于痴呆研究,基于治未病的“既病防变”理论,运用针灸干预痴呆早期出现的主要症状,以嗅觉功能障碍为切入点,最终延缓痴呆的发病进程,并命名该治疗方法为“嗅三针”疗法[8-9]。

“嗅三针”由两侧迎香、印堂组成,印堂在鼻根部,迎香在鼻翼两侧,二穴均能治疗鼻部疾病。《灵枢·脉度》:“肺气通于鼻,肺和则鼻能知臭香矣。”《医林改错·脑髓说》曰:“灵机记性在脑者,因饮食生气血,长肌肉,精汁之清者化而为髓,由脊骨上行。入脑,名曰脑髓……鼻通于脑,所闻香臭归于脑。脑受风热,脑汁从鼻流出,涕浊气臭,名曰脑漏……鼻微知香臭”[10]。《本草纲目·辛夷条》有云:“鼻气通于天。天者,头也、肺也。”由此可以看出,古人对于鼻和脑部结构功能的认识和理解,脑功能的正常与否,能够影响鼻识别香臭之气。同时,鼻能将所接触的信息感知、感传于脑,鼻与脑的这种特殊关系,为从嗅觉治疗脑部疾病提供一定理论依据。

运用嗅三针治疗痴呆早期出现的嗅觉功能减退,或是嗅觉障碍,发现其对痴呆出现的认知障碍也有较好改善作用[11-12]。迎香属手阳明大肠经与足阳明胃经交会穴,刺之可宣通阳明而达到开鼻窍之功。印堂为督脉穴,《素问》曰:“督脉者……上额交颠上,入络脑”。督脉为“阳脉之海”,连接脑之阳、全身之阳,刺之可调理督脉而达到醒脑之效。嗅三针既能治疗鼻部嗅觉功能障碍,又对认知障碍有改善作用。因此,将该针法凝炼为“感知一体,嗅脑同治”,总结其机制为“通督宣阳,开窍醒神”,二穴功能主治与嗅觉系统密切相关,形成嗅三针的理论依据[13-15]。

慢性低灌注导致的脑组织损伤是VD发病的主要病因,脑在低灌注缺血缺氧过程中,氧化应激反应是其最早出现的核心事件之一[16-17]。脑缺血缺氧时产生的毒性物质,对细胞膜、细胞器均产生破坏作用,增加了氧化应激反应程度,诱导线粒体稳态失衡,最终引起海马神经细胞坏死、凋亡,引起学习、辨识、记忆等认知功能障碍[18-19]。氧化应激与VD发病过程密切相关,Keap1/Nrf2/ARE信号通路的激活,活化Nrf2积聚游离入核,启动抗氧化反应,调节下游抗氧化酶基因转录和表达,调控氧化应激反应,介导脑内神经细胞保护作用[19]。Nrf2能够调动下游HO-1、NQO1等抗氧化酶活性,促进多种抗氧化还原酶表达,实现抗氧化应激反应[20]。本研究中,嗅三针改善了VD大鼠海马CA1区病理组织形态,而运用Nrf2抑制剂后,该作用明显减弱,与模型组比较,嗅三针明显提高了Nrf2表达量,其下游HO-1、NQO1蛋白表达明显增多,Nrf2抑制剂组Nrf2的阳性细胞率减少,其下游HO-1、NQO1蛋白表达明显减少。可见,Nrf2的激活在嗅三针治疗中发挥着重要作用。

综上所述,治疗VD早期出现嗅觉障碍的嗅三针能够改善大鼠认知功能障碍,通过激活Nrf2,调节下游HO-1、NQO1等蛋白表达,对抗VD大鼠出现的氧化应激,改善其认知功能状态,这可能是嗅三针治疗VD的重要机制。