酸枣仁汤醇提取物与经典方剂的非临床安全性比较试验

雷夏凌,林靖,柳璐,黄远铿,郭健敏,杨威

(广州湾区生物医药研究院,广东莱恩医药研究院有限公司,广东省药物非临床评价研究企业重点实验室,国家中药现代化工程技术研究中心中药非临床评价分中心,广东省创新药物评价与研究工程技术研究中心,广东 广州 510990)

我国的二十大报告中提出了“推进健康中国建设,促进中医药传承创新发展”,中医药发展有着数千年的历史,而经典方剂在应用上积累了丰富的经验,有着巨大的开发价值。经典方剂为中医经典医著《伤寒论》《金匮要略》《温病学》所记载而获名,我国史上有文字记载的古代经典方剂有近10万个,但仅很小部分进行了现代的研究开发,其主要原因为基础研究不足,特别是非临床研究数据的匮乏,多数常用中药没有科学、规范的现代毒理研究数据及比较试验,以至于无法进行科学、合理的质控和风险监管。国务院在2017年发布的《关于深化审评审批制度改革鼓励药品医疗器械创新的意见》提出鼓励运用现代科学技术研究开发传统中成药,《中华人民共和国中医药法》(2017年)也指出古代经典名方的中药复方制剂,在申请药品批准文号时,可以仅提供非临床安全性研究资料,积极推动了古代经典名方传承创新,拓展了古代经典名方中药复方制剂的内涵。

来源于《金匮要略》的酸枣仁汤,用于治疗肝血不足、虚热内扰引起的虚烦不得眠症的经典方剂,现代药理研究也表明,酸枣仁汤具有治疗失眠、抗焦虑、抗抑郁、神经官能症等作用,疗效确切[1-3]。当今睡眠障碍为全球性严重问题,直接影响人类身心健康,临床治疗以苯二氮类药物为主,不良反应较多,酸枣仁汤作为经典方剂应用历史久远且安全有效[4-7],具有临床价值,但至今仍未广泛应用的中药制剂[8]。本实验受试物为酸枣仁汤醇提取物,应用现代分离分析技术筛选、提取和分离出的有效部位正丁醇和多糖,具有质量可控、减少服用量及药效试验效果显著的优势,为了进一步论证其安全性,开展酸枣仁汤醇提取物亚急性毒性试验研究,并与传统工艺的酸枣仁汤经典方剂比较,为其进一步的研究开发提供依据,具有创造性价值。

1 实验材料

1.1 药物及制备酸枣仁汤醇提取物由酸枣仁、知母、川芎、茯苓、甘草组成,沈阳药科大学提供,批号:201604001;临床拟定用法或用量为口服,每天2～4次,每次39 g生药。酸枣仁汤经典方剂由原沈阳军区总医院配制,批号:20151212,8 g/袋。临床用法或用量为开水冲服,一次1袋或1次1～2袋,睡前服用。酸枣仁汤醇提取物、酸枣仁汤经典方剂均使用0.5% CMC-Na溶液配制所需浓度。

1.2 实验动物SD大鼠,SPF级,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,5周龄,体重150～220 g,72只,雌雄各半,实验动物生产许可证号:SCXK(湘)2016-0002,实验动物质量合格证明号:43004700038208、43004700022903。动物饲养于SPF级动物房,实验动物使用许可证号:SYXK(粤)2015-0146,所有环境技术指标均符合GB14925-2010屏障环境技术要求。本研究实验动物的申请和使用已通过本机构IACUC的同意和认可。

1.3 仪器SYSMEX XT-2000i型血液分析仪;日立7020全自动生化分析仪;SYSMEX CA1500全自动血凝分析仪;BSA2201、BSA2202S、SQP PRACTUM5100-1CN、BSA423S电子天平。

2 实验方法

2.1 酸枣仁汤醇提取物对SD大鼠亚急性毒性试验试验选取适应性观察合格的SD大鼠40只,按体重随机均衡分成4组,分别为阴性对照组、酸枣仁汤醇提取物低、中、高剂量组,各组剂量分别为42.06、98.28、140.53 g·kg-1(生药)组,140.53 g·kg-1(生药)组原剂量为196.465 g·kg-1(生药),按最大给药剂量设置,可引致3/10例动物在给药3 d后死亡,停药2 d后,从第6天起剂量下调到140.53 g·kg-1(生药),各组均以15 mL·kg-1灌胃给药,每天2次,连续给药28 d。试验期间,按《药物重复给药毒性试验技术指导原则》(2014.5)要求,每天观察动物的外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状、死亡情况等,每周测定动物摄食量及体重,每周按体重调整给药量。在给药第28天后处死动物,进行血液学、血液生化学、病理学等各项检查。

2.2 酸枣仁汤经典方剂对SD大鼠亚急性毒性试验试验选取适应性观察合格的SD大鼠32只,按体重随机均衡分成4组,分别为阴性对照组、酸枣仁汤经典方剂低、中、高剂量组,各组剂量分别为56.12、140.29、224.46 g·kg-1(生药)组,224.46 g·kg-1(生药)为最大给药剂量,140.29 g·kg-1(生药)设置考虑与酸枣仁汤醇提取物高剂量组平行,各组均以15mL·kg-1灌胃给药,各组每天灌胃给药两次,连续给药28 d。试验期间,按“2.1”项下要求观察、测量、调整给药量,并进行各项检查。

3 结果

3.1 酸枣仁汤醇提取物对SD大鼠亚急性毒性试验

3.1.1 临床观察高剂量组从给药第2天开始,全部动物陆续出现竖毛、少动、弓背、局部毛稀疏、肛门周围附着褐色液体状排泄物等症状;在第4天,3/10例动物(♀2、3、5)出现死亡。中剂量组从给药第3天起开始,7/10例动物陆续出现竖毛、局部毛稀疏等症状。低剂量组从给药第18天开始,3/10例动物陆续出现局部毛稀疏的症状。以上变化给药期间未见恢复。

3.1.2 摄食量及体重各给药组摄食量各检测时间点未见明显异常变化。高剂量组雌性动物在第7天体重呈现负增长且明显轻于阴性对照组;高剂量组雄性动物在第7、21、28天的体重及末期增重均低于阴性对照组。

表1 酸枣仁汤醇提取物连续28 d经口给药对SD大鼠体重的影响

3.1.3 血液学检查高剂量组雄性动物白细胞数(WBC)升高,红细胞数(RBC)、血红蛋白量(HGB)有所降低。高剂量组雌、雄性动物网织红细胞数(RET)及比率、中性粒细胞数(NEUT)升高。

表2 酸枣仁汤醇提取物连续28天经口给药对SD大鼠血液学的影响

3.1.4 生化学检查高、中剂量组雌性动物及高剂量组雄性动物的丙氨酸氨基转移酶(ALT)有所升高,高、中剂量组雄性动物甘油三酯(TG)降低,以上变化在正常变化范围内。

3.1.5 脏器重量和脏器系数高、中剂量雌性动物肝脏有所增重,高、中剂量雄性动物胸腺减轻。

3.1.6 病理学检查各组存活动物系统解剖均未见异常。死亡动物系统解剖发现,2例动物出现肺部淤血、胃胀气,1例动物出现胃胀气的改变。对死亡动物进行组织病理学检查发现,1例动物(高剂量♀3)出现肝点灶性坏死;2例动物(高剂量♀3、♀5)出现肾小管上皮细胞变性坏死、空泡变性。致死原因可能与肾功能障碍相关,详见图1～3。

图1 高剂量雌性3号:肝脏点灶性坏死(H-E染色,200×)

图2 高剂量雌性3号:肾小管上皮细胞空泡变性坏死(H-E染色,100×)

图3 高剂量雌性5号:肾小管上皮细胞空泡变性坏死(H-E染色,200×)

3.2 酸枣仁汤经典方剂对SD大鼠亚急性毒性试验

3.2.1 临床观察酸枣仁经典方剂低、中、高剂量组动物临床观察中有个别动物出现软便症状。

3.2.2 摄食量及体重给药期间,酸枣仁经典方剂汤低、中剂量组雌雄动物与阴性对照组摄食量相近,未见明显差异。酸枣仁汤经典方剂高剂量组雄性动物体重增长减慢。

表3 酸枣仁汤醇提取物连续28 d经口给药对SD大鼠生化学的影响

表4 酸枣仁汤醇提取物连续28 d经口给药对SD大鼠脏器重量、脏体系数、脏脑系数的影响

3.2.3 血液学检查高剂量组雄性动物RET、RET%升高,高剂量组雌性动物RBC、HGB与HCT降低。

3.2.4 生化学检查各剂量组各指标均未见明显异常。

3.2.5 脏器重量和脏器系数酸枣仁汤经典方剂低、中剂量组可见雌性动物肝脏有所增重,但无剂量-反应关系,且肝功能指标未见异常,以上变化无生物学意义。

3.2.6 病理学检查各组存活动物系统解剖均未见明显异常改变。

表5 酸枣仁汤经典方剂连续28 d经口给药对SD大鼠体重的影响

表6 酸枣仁汤经典方剂连续28 d经口给药对SD大鼠血液学红细胞的影响

表7 酸枣仁汤经典方剂连续28 d经口给药对SD大鼠血清生化的影响

表8 酸枣仁汤经典方剂连续28 d经口给药对SD大鼠脏器重量、脏器系数的影响

4 讨论与结论

酸枣仁汤来源于医圣张仲景的《金匮要略血痹虚劳病脉证并治》的失眠名方,现代研究表明其主要活性成分为多糖、黄酮、皂苷、生物碱、三萜等,具有抗抑郁、增强学习能力、治疗失眠等药理作用[9]。有关酸枣仁汤的动物毒性试验文献报道较少,王丽娟等[10-11]进行酸枣仁油和酸枣仁提取物急性毒性、长期毒性试验,研究结果均未见明显异常。

本研究中酸枣仁汤提取物为酸枣仁汤醇提取液,按原方配比,五味中药以现代分离方法提取其中的有效成分并进行定量所得的有效部分,以期运用新技术新工艺的优势开发中药创新药;酸枣仁汤颗粒剂经典方剂为酸枣仁汤方剂传统水煎的浓缩液。本毒性试验结果表明,酸枣仁汤醇提取物连续给药28 d,以临床用量的14倍即196 g生药/kg给药3 d致SD大鼠出现死亡,致死原因可能与肾功能障碍相关,降低剂量为140 g生药/kg即临床用量的10倍动物仍出现明显的毒性反应,其对SD大鼠的NOAEL为98.28 g生药/kg;酸枣仁汤经典方剂连续给药28 d,酸枣仁汤颗粒剂经典方剂以224 g生药/kg、140 g 生药/kg为临床用量的16、10倍给药1个月,动物未见出现死亡和明显毒性反应,对SD大鼠的NOAEL为224.6 g生药/kg;两个受试物高剂量组动物均出现红细胞数量的轻度减少及骨髓造血功能(红细胞系)代偿性升高,酸枣仁汤醇提取物非临床安全性研究存在较大的安全性风险,毒性反应明显大于经典方剂。上述试验结果提示,酸枣仁汤颗粒剂经典方剂的毒性明显高酸枣仁汤新工艺提取物,表现为轻度贫血和肾功能障碍,未发现相关的文献报道,具体机理不明确,酸枣仁汤出现了非传统工艺下复方制剂的毒性,表现为方与药毒性分离,分析产生的原因可能如下:经典传统方剂通过配伍、制剂、用量限制了单味药的毒性,而新工艺提取有效部位可能引起配伍、制剂等失当,致全方毒性增强或出现单味中药无关的毒性。

因此,酸枣仁汤以古代经典传统方剂进行二次开发时,需考虑中药多成分、多靶点、多效应的物质内涵,往往工艺、用量等改变会影响其药效与毒效,因此需深化非临床安全性研究。由于酸枣仁汤新工艺提取物非临床安全性研究存在较大的安全性风险,需进行研究开发策略的调整,本品不建议进行中药创新药的注册申报,但可开展古代经典名方中药复方制剂的申报的研究开发,并继续对酸枣仁汤的有效成分、作用机理及其代谢过程的继续进行深入的研究和探讨,为临床提供足够的理论依据。