新冠病毒SARS-CoV-2主蛋白酶3CLpro抑制剂的多步虚拟筛选

杜宏金,余晓谭,李翰旭,万洛婷,邹瑜

(1.国家药品监督管理局药品审评中心,北京100038;2.武汉科技大学医学院药学系,湖北省职业病预防与控制重点实验室,湖北 武汉 430070;3.华中科技大学同济医学院药学院,湖北 武汉 430030)

自2019年12月新型冠状病毒肺炎爆发以来,全球陷入了持续的社会和经济的混乱。截至2023年4月,全球累计确诊病例已超过6亿,累计死亡病例超过600万例。新型冠状病毒SARS-CoV-2(又名2019-nCoV)是新型冠状病毒肺炎的致病因子,目前此病毒已变异分化出多种亚型,并且有可能持续变异[1]。因此,我们需要开发出一套,能快速筛选出对新冠病毒有抑制力先导化合物的方法,加快药物研发进程。

冠状病毒是一大类单链包膜RNA病毒,可分为4大类,其中SARS-CoV-2属于β属[2]。冠状病毒通过刺突蛋白结合表面受体进入宿主细胞[3]。SARS-CoV-2的表面受体是血管紧张素转换酶2(ACE2)[4]。病毒进入宿主细胞后,其阳性基因组RNA直接附着于宿主核糖体,然后将两个大的共端多聚蛋白经主蛋白酶加工成相应的组件,用于组装新的病毒。为了复制RNA基因组,冠状病毒编码一种复制酶,它是一种RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)[5]。因此从机制可以看出,SARS-CoV-2靶向药物的靶标主要包括ACE2,主蛋白酶和RdRp。目前为止,国内已批准的抗新冠主蛋白酶3CLpro抑制剂包括辉瑞公司的奈玛特韦片/利托那韦片、先声药业的先诺特韦片/利托那韦片、广东众生睿创生物科技有限公司的来瑞特韦片用于治疗轻中度新冠肺炎患者,前两款药物为主蛋白酶3CLpro抑制剂与利托那韦组合包装产品联合治疗产品,后一种药物为主蛋白酶3CLpro抑制剂单药治疗产品。SARS-CoV-2主蛋白酶的X射线晶体结构已经揭示,为基于结构的药物发现工作提供了极好的基础[6]。因此,主蛋白酶是SARS-CoV-2药物再利用的有希望的靶标。

在本研究中,我们使用SARS-CoV-2的主蛋白酶(PDB ID:6LU7)作为受体蛋白,对来自ZINC 药物数据库的5 811个化合物进行了3轮虚拟筛选:基于结构的筛选,基于配体的筛选和基于药理学的筛选。由此从数据库中获得了11个具有高亲和力、高拟合值和适当药理作用的分子。

1 材料与方法

1.1 基于结构的 ZINC 数据集虚拟筛选将来自ZINC 数据库的 in-trails dataset数据集导入OpenBable工具中,以实现能量最小化,并将SDF文件转换为PDBQT文件。通过主蛋白中的不可逆共价抑制剂N3定义活性口袋位置以15×15×15的大小、-0.71×12.41×68.83的坐标覆盖SARS-CoV-2的活性位点,并在绑定的口袋内覆盖必需残基,使用AutoDock Vina进行对接。使用Discovery studio Visualizer和Pymol程序确定最佳构象时分子的相互作用和结合模式,根据化合物的对接分数(kcal·mol-1)对化合物进行排名,结合亲和力小于-8的化合物被认为是hit化合物。

1.2 基于配体的药效团模型的构建SARS-CoV-2和SARS-CoV在其解码的主蛋白酶中具有96%的序列同一性。在催化区域中,两种蛋白酶之间有差异的大多数残基在蛋白质表面上。S46(2019-nCoV)/A(SARS-CoV)可能与结合活性位点的底物或抑制剂相互作用。然而,从A到S的微小变化预计不会显著干扰小分子抑制剂与活性位点的结合。因此,有效抑制SARS-CoV主蛋白酶的抑制剂也有望对SARS-CoV-2的主蛋白酶起类似作用[5]。通过比较和叠加一系列活性相似但结构不同的化合物的特征结构,可以生成一套基于配体的药效团模型。再通过评价和验证后,选取最佳的药效团模型用于虚拟筛选小型化合物数据库,搜索潜在的药物[7]。基于训练集活性分子结构多样性的原理,我们选取了文献报道的16种SARS冠状病毒类主蛋白酶抑制剂构建训练集(如表1所示)。

根据活性分子的IC50值,我们定义了Principal和Max Omit Feat的性质。对于IC50≤1 μmol·L-1的活性分子,Principal定义为2,确保参考分子在构建药效团空间时考虑了分子中的所有化学特征,Max Omit Feat定义为0,意味着药效团模型中的所有特征元素都需要与参考化合物匹配。对于IC50在1 ～ 100 μmol·L-1之间的中等活性分子,Principal定义为1,其中考虑了该分子的构象,Max Omit Feat定义为1,表示药效团模型中的某个特征元素对于化合物可以省略。选择疏水性(HYD)特征、氢键受体(HBA)、氢键供体(HBD)、芳香环中心(RA)作为特征药效团特征。基于训练集分子的活性构象,利用Discovery Studio 2016的共同特征药效团生成模块(Common Feature Pharmacophore Generation)构建模型(如图1所示)。

图1 16种SARS冠状病毒类主蛋白酶抑制剂的化学结构

1.3 药效团模型的评价和验证能否准确预测分子针对靶标的活性,药效团模型是关键。因此,必须选用合适的方法评价药效团模型,为此我们构建了一个测试集来比较不同药效团的识别能力。测试集共包含5 408个分子,分为阳性测试组和阴性测试组。其中阳性测试组的24个分子是随机选择的已过生物活性测试的化合物,阴性测试组的5 384个分子取自Drug Like Diverse数据库。我们使用两个参数SE(灵敏度)和SP(特异性)来评估药效团的预测能力。SE值代表模型识别活性分子的能力,SP值代表模型识别非活性分子的能力。两者的值越接近于 1,表示药效团的识别能力越强。SE定义为真阳性(TP)与真阳性(TP)和假阴性(FN)之和的比率:SE=[TP/ (TP+ FN)]。SP 定义为真阴性(TN)与真阴性(TN)和假阳性 (FP) 之和的比率:SP=[TN/ (TN+ FP)]。我们使用十个生成的药效团来筛选阳性测试组和阴性测试组,分别计算出 SP 和SE 值。筛选由Discovery Studio中的Ligand Profile模块进行,每个化合物产生 200个构象来绘制药效团。能量阈值设置为 10,以避免不合理的构象;拟合方法设置为灵活,最大省略特征设置为0,这意味着化合物需要映射所有药效团特征。

1.4 基于配体的数据集虚拟筛选经评价和验证后,选择最佳的药效团模型作为3D query,从分子对接的结果中筛选化合物。参数设置与上一步相同。我们将拟合值的阈值设定为3.5。

1.5 基于药理学的最终数据集筛选虚拟筛选的计算结果良好并不意味着化合物实际上对SARS-CoV-2有良好的抑制作用。因此,化合物还需要一步的药理学筛选。我们查询了上一步筛选出的化合物的全部已报道的药理作用,并挑选出了所有与抗病毒有关的药物。

2 结果与讨论

2.1 基于结构的虚拟筛选结果虚拟筛选由PyRx执行。我们选择了结合亲和力小于- 8 kcal·mol-1的分子,共有678个分子。

2.2 基于配体的药理学模型的特点及可靠性验证我们构建了10个基于配体的药效团模型,相关参数见表2。综合考虑SE值和SP值,我们决定选用模型4。

表2 10个药效团模型的特征、试验组和试验结果

TP:真阳性,该化合物既有生物活性,又经药效团筛选;TN:真阴性,该化合物无生物活性,未被药效团筛选;FP:假阳性,该化合物没有生物活性但已被药效团筛选出来;FN:假阴性,化合物具有生物活性,未被药效团筛选;SE:灵敏度,SE=[TP/(TP+ FN)];SP:特异性,SP=[TN/(TN+ FP)]。

模型4以HHAA为特征,包含4个HBA和2个HYD。模型4对训练集的化合物组具有高度敏感性(SE=0.833)和高度特异性(SP=0.840),与训练集分子匹配良好,因此模型的可靠性很高(如图2所示)。

氢键受体特征显示为绿色球体,疏水性特征显示为蓝色球体图2 训练化合物CHEMBL242436绘制的药效团模型4

2.3 基于配体的虚拟筛选结果和基于药理学的筛选结果模型 4 用作 3D query来筛选步骤 1 中的化合物库,共有484个分子通过了筛选。Fit 值大于3.5的分子有137个。在经过基于药理学的筛选之后,剩下11个分子(如表3所示)。

表3 最终筛选出的11种化合物的计算结果和药理作用

表6 含量测定结果(mg/100 g,n=2)

3 结论

COVID-19 的爆发引起了全世界的恐慌、社会和经济的混乱,并且疫情仍在全球蔓延。对已上市药物进行计算机虚拟筛选从而发现抗SARS-CoV-2 药物为一种快速而经济的方法。因此,我们选择ZINC的in-trials 数据集作为我们的筛选数据集,建立多重筛选的方法寻找潜在的抗SARS-CoV-2药物。

本研究中,我们使用由3个步骤组成的虚拟筛选工作流程来筛选数据库,并确定11种潜在抑制剂。这3个步骤包括基于结构的虚拟筛选、基于配体的虚拟筛选和基于药理学的筛选。这些药物大部分是抗病毒药物,不仅与SARS-Cov-2主蛋白酶有很好的亲和力,而且与药效团模型有很好的拟合。

至此,我们的研究在一方面可以大大缩小药物筛选的范围,因为它们可以尽快进行体外实验,以确定它们对SARS-CoV-2是否具有抑制作用;另一方面,我们提供了一组可用于虚拟筛选的方法和模型,对其他类似的药物虚拟筛选具有借鉴意义。未来我们可以使用更大的数据库进行虚拟筛选,从而加速人类寻找针对 COVID-19 的有效药物的过程。