沙棘籽油软胶囊中4种生育酚的含量测定

董蓬,王小兵,李启艳,吴晓云,于海英,谢强胜,郭东晓

(山东省食品药品检验研究院,国家药品监督管理局化妆品原料质量控制重点实验室,特色植物资源化妆品济南市工程研究中心,山东 济南 250101)

沙棘为胡颓子科沙棘属植物Hippophae[1-3]的干燥成熟果实。《中国药典》收载的沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)又名醋柳(山西)、黄酸刺、酸刺柳(陕西)、黑刺(青海)、酸刺(内蒙古),主产于内蒙古、河北、山西、陕西、甘肃、宁夏等省[4-5],是原国家医药局和原卫生部联合公布的药食同源植物。沙棘的籽、果皮、果实及果渣中都有一定量的油脂,成熟的沙棘籽中含有8%～20%的油脂,研究发现沙棘籽油中含有维生素E、类胡萝卜素、不饱和脂肪酸等人体必需的多种营养成分,有辅助降血脂、保肝、抗氧化、醒脾健胃等多种作用,在医药及保健食品领域有广阔的应用前景[6-9]。

维生素E即生育酚,是人体必需的脂溶性维生素,也是良好的抗氧化剂和营养剂,在水果、蔬菜、坚果及粮食等食物中广泛存在。天然维生素E主要有4种,即α、β、γ和δ-生育酚,其中α-生育酚活性最强。生育酚具有多种生物活性,包括抗癌、抗衰老、抗动脉硬化、护肝、预防白内障、延缓早老性痴呆、治疗胃溃疡、调节血压等[10-11]。

目前,已批准的沙棘籽油单方保健食品(沙棘籽油系以沙棘籽为原料经压榨、浸出、超临界CO2萃取等方法提取获得)主要剂型为软胶囊,均采用企业自拟标准,各企业对其产品中生育酚类成分的在检验方法、指标成分数量、含量限度等质量控制方面存在较大差异,这也导致各企业产品质量差异较大。为了更好地控制产品质量,我们建立了沙棘籽油软胶囊中4种主要生育酚类成分的含量测定方法。

1 仪器和试剂、试药

1.1 仪器Waters2695e高效液相色谱仪(美国Waters公司);Mettler Toledo电子天平(瑞士梅特勒-托利多集团);KQ-500E型医用超声洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 试剂、试药甲醇为色谱纯,购自天津康科德科技有限公司;其他试剂均为分析纯。α-生育酚购自Sigma公司,批号:LRAB6618;β-生育酚对照品购自北京曼哈格生物科技有限公司,批号:20139-810;γ-生育酚购自Sigma公司,批号:LRAB6868;δ-生育酚购自Sigma公司,批号:LRAB6868。3批样品购自河北神兴沙棘研究所,批号分别为20171104、20171105、20171106(规格均为0.65 g/粒);2批样品购自内蒙古宇航人高技术产业有限责任公司,批号分别为20171101、20180120(规格均为0.5 mL/粒)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为Agilent Poroshell 120 PFP柱(4.6 mm×250 mm,4 μm);流动相为甲醇-水(94∶6);检测波长为294 nm;柱温为26 ℃;流速为0.9 mL·min-1;进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备分别取α、β、γ和δ-生育酚适量,精密称定,加无水乙醇制成每l mL含1.00 mg的单标溶液,作为储备溶液。分别精密量取5.0 mL,置同一50 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,4种生育酚浓度约为100 μg·mL-1,作为混合标准溶液中间液。分别精密量取0.2、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,作为标准系列溶液。同时对对照品溶液进行含量标定。

2.3 供试品溶液的制备[12]皂化:取本品0.5 g,精密称定,置150 mL平底烧瓶中,加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g二丁基羟基甲苯(BHT),混匀,加入30 mL无水乙醇,加入20 mL氢氧化钾溶液(50 g/100 g),沸水浴中回流皂化30 min,皂化后立即用冷水冷却至室温。

提取:将皂化液用30 mL水转移至250 mL的分液漏斗中,加入50 mL石油醚(60～90 ℃)-乙醚混合液(体积比1∶1),振荡萃取5 min,将下层溶液转移至另一250 mL的分液漏斗中,加入50 mL的混合醚液再次萃取,合并醚层。

洗涤:用约100 mL水洗涤醚层,重复3次,直至将醚层洗至中性,去除下层水相。

浓缩:经洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3 g)滤入250 mL旋转蒸发瓶中,用约15 mL石油醚(60～90 ℃)冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次,并入蒸发瓶中,并将其接在旋转蒸发仪上,于40 ℃水浴中减压蒸馏,待瓶中醚液剩下约2 mL时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10 mL容量瓶中,定容至刻度,滤过,供HPLC测定。

除不加样品外,其余同供试品溶液制备方法制得阴性对照样品溶液,结果见图1。

1.δ-生育酚;2.β-生育酚;3.γ-生育酚;4.α-生育酚图1 HPLC色谱图

2.4 线性取标准系列溶液,按上述色谱条件,注入液相色谱仪,测得峰面积。以峰面积为纵坐标,对照品浓度为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程,结果见表1。

表1 线性关系考察

2.5 精密度试验取同一混合对照品溶液,每次进样10 μL,连续进样6次,测定4种生育酚的(A)峰面积值,结果RSD在1.15%～1.67%之间,表明精密度良好。

2.6 稳定性试验取同一混合对照品溶液,在0、2、4、6、12、24 h分别进样10 μL,测定4种生育酚的(A)峰面积值,结果RSD在1.07%～1.78%之间,表明在24 h内稳定。

2.7 重复性试验取批号为20171104的供试品,按照“2.3”项下方法制备供试品溶液6份,α、β、γ和δ-生育酚平均含量分别为91.1、16.3、65.9、8.5 mg/100 g,4种成分含量测定值(n=6)RSD在0.85%～1.56%之间。

2.8 回收率试验精密称取批号为20171104(α、β、γ和δ-生育酚含量分别为91.1、16.3、65.9、8.5 mg/100 g)的供试品6份,每份约0.25g,精密加入4种生育酚的混合对照品溶液(α、β、γ和δ-生育酚浓度分别为0.228 7、0.046 6、0.183 7、0.022 2 mg·mL-1)1 mL,置同一150 mL平底烧瓶中,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,照“2.1”项下色谱条件测定,计算回收率,结果见表2～5。

表2 α-生育酚加标回收试验

表4 γ-生育酚加标回收试验数据

表5 δ-生育酚加标回收试验数据

2.9 样品测定取样品,按上述方法进行处理,测定含量,结果见表6。

3 讨论

在生育酚含量测定样品处理过程中,考察了皂化时间的影响,分别考察了皂化10、20、30、40 min,结果皂化10、20 min所测含量偏低,而30、40 min所测含量基本一致,为提高效率,选择皂化30 min。在固定检测波长294 nm的情况下,采用乙腈-水和甲醇-水及不同的比例试验,最后确定以甲醇-水(94∶6)为流动相,4种生育酚的分离效果最好。

沙棘籽油中营养成分复杂,为全面反映产品质量,应加强各类成分的质量控制方法开发,推动制定相关质量标准,从而保障其安全性、有效性和质量可控性。本文建立了沙棘籽油软胶囊中4种主要生育酚的含量测定方法,该方法重复性好、专属性强,为其质量控制提供了技术支持。