外周血循环circRNAs作为肺癌诊断标志物的荟萃分析*

鲍绿地,徐秋月,段勇(1.昆明医科大学第一附属医院医学检验科,昆明 650032;2.红河卫生职业学院医学检验教研室,云南红河 661100;3.云南省检验医学重点实验室,昆明 650032;4.云南省医学检验临床研究中心,昆明 650032)

随着生物信息学和高通量测序技术迅速发展,不断有研究发现环状RNA(circRNAs)在人类疾病相关组织和细胞以及正常组织中广泛表达[1],在人体的多种复杂功能和机制中发挥关键作用。circRNAs参与了各种恶性肿瘤的增殖、转移和侵袭,在外泌体和体液中含量丰富,可通过细胞间通讯对肿瘤微环境产生影响[2-3]。根据我国国家癌症中心2022年公布的最新统计,肺癌仍然是癌症死亡的第一大原因[4]。由于目前用于早期筛查肺癌的方法敏感性和特异性都不理想,易误诊和漏诊,多数肺癌患者初次就诊时已经处于中晚期,错过了最佳根治性手术治疗时机[5-6]。因此,迫切需要探索早期具有高敏感性和特异性的非侵入性肺癌诊断方法应用于临床。研究显示,肺癌患者外周血中多种循环circRNAs存在明显差异表达,有潜力作为诊断肺癌的生物学标志物[7]。本研究旨在通过荟萃(Meta)分析评估外周血循环circRNAs对肺癌患者的诊断价值,以期为肺癌患者寻找理想的诊断标志物提供依据。

1 材料和方法

1.1文献检索策略 系统检索Ovid(https://ovidsp.ovid.com/)、Scopus(http://www.scopus.com/)、PubMed、Web of Science、Embase(https://www.embase.com/)、CBM(http://www.sinomed.ac.cn/)、Cochrane图书馆、知网、万方和维普十个数据库中公开发表的关于circRNAs诊断肺癌的临床研究文献,检索时限为建库至2023年1月。以主题词结合自由词的方式检索,检索主题词包括:“RNA, Circular”、“环状RNA”、“lung neoplasms”、“肺癌”、“sensitiv*”、“predictive”、“诊断”,自由词包括:“circRNAs”、“closed circular RNA”、“circular RNA”、“circRNA”、“sensitivity and specificity”、“predictive value of tests”、“pulmonary neoplasms”、“肺肿瘤”、“pulmonary cancer”等。由两名研究者根据文献检索流程检索文献,筛选出文献提取特征数据并录入表格中,筛选及特征数据提取过程中遇到任何分歧时邀请第三名研究者讨论。

1.2文献纳入及排除标准

1.2.1文献纳入标准 (1)仅限于评估外周血循环circRNAs对肺癌患者诊断价值的临床性研究;(2)肺癌患者有明确的病理组织诊断;(3)研究对象为肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)组和健康人对照组;(4)研究中能直接获得外周血循环circRNAs诊断肺癌的敏感性(sensitivity, Sen)、特异性(specificity,Spe)、样本量等信息;(5)文献语言为英文或中文。

1.2.2文献排除标准 (1)重复发表的文献或不同文献来源于同一组数据;(2)综述、系统评价、Meta分析文献等;(3)以肺癌病理组织为标本的临床性研究;(4)无法直接获取相关数据的研究,包括病例组及对照组数量、敏感性、特异性等;(5)非人体的临床研究。

1.3文献筛选和资料提取 将检索到的文献全部导入EndNote X 9 文献管理软件进行文献管理,根据纳入及排除标准筛选出研究文献。从研究文献中提取特征数据,包括第一作者、发表年份、肺癌类型、病例组及对照组数量、标本来源、circRNAs及其表达水平、检测方法、敏感性、特异性、ROC曲线下面积(AUCROC)、患者临床病理参数、circRNAs检测方法与试剂等。

1.4统计学分析 利用RevMan 5.3软件根据诊断试验质量评价表(quality assessment of diagnostic accuracy studies)中的QUADAS-2工具表对纳入研究的文献进行质量评价,包括风险偏倚和临床适用性评价[8]。使用Meta DiSc 1.4软件进行统计分析和查找异质性来源,在异质性分析中,如果I2≤50%或P≥0.10时采用固定效应模型合并效应量,如果I2>50%或P<0.10,使用随机效应模型合并效应量,通过原始的TP、FP、FN、TN值绘制综合ROC曲线(SROC)并计算AUCROC用以评价诊断价值,以P<0.05为差异有统计学意义。采用StataMP 14.0软件绘制Galbraith图与Deeks漏斗图,对纳入研究的数据进行敏感性分析和Deeks偏倚检验。

2 结果

2.1检索结果 文献检索流程见图1,初步检索共获得600篇相关文献,删除重复文献、综述、系统评价、Meta分析文献等后剩余264篇,进一步通过阅读文献标题、摘要及阅览全文筛选,最终纳入15篇符合标准的文献[9-23]。

2.2文献基本特征 本次研究共纳入15篇文献,包含17种circRNAs。所有肺癌病例均经过病理组织学检查确诊,对照组为同期体检健康者。各研究的circRNAs均来自于外周血液标本。纳入研究的文献基本特征见表1。

2.3纳入研究的文献质量评价 对纳入研究的文献质量和偏倚风险使用RevMan 5.3软件根据诊断试验QUADAS-2质量评价工具表进行评价,结果见图2。所有纳入研究的文献得分均为4～6分,为低度偏倚风险,表明纳入研究的文献质量较高。

图2 根据 QUADAS-2 质量评价工具表进行质量和偏倚风险评价结果

2.4诊断价值分析

2.4.1阈值效应 将纳入研究的数据导入到Meta DiSc 1.4软件进行分析,得出敏感性对数与(1-特异性)对数之间的Spearman相关系数(r)为0.326(P=0.217),结果不显著,表明本次研究不存在阈值效应。绘制对称SROC曲线没有出现“肩臂状”,本次研究无阈值效应。见图3。

图3 SROC曲线

2.4.2诊断性试验的评价指标 经诊断比值比(DOR)的Cochran-Q检验得出Cochran-Q=53.17,P<0.001,表明本研究存在非阈值效应引起的异质性,并且本次研究的敏感性、特异性、阳性似然比、阴性似然比、DOR的I2均大于50%,故而采用随机效应模型进行以上5个效应量的合并。结果显示,应用外周血循环circRNAs诊断肺癌的合并敏感性为0.707(95%CI:0.682～0.731),合并特异性为0.792(95%CI:0.766～0.817),合并阳性似然比3.294(95%CI:2.599～4.175),合并阴性似然比0.359(95%CI:0.295～0.436),合并SROC AUCROC=0.839 7,Q指数=0.771 5;合并DOR为11.520(95%CI:7.433～17.853)。见图4。

图4 外周血circRNAs诊断性试验的评价指标

2.4.3异质性来源分析 根据纳入研究的文献中能获取的资料[发表时间、样本类型、样本数量、病理类型、circRNAs表达、内参基因、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂公司]进行Meta回归,结果显示,检测时选择的内参基因会对本次研究结果的异质性呈显著影响(P<0.05),而发表时间、样本类型、样本数量、病理类型、circRNAs表达、qRT-PCR试剂公司的影响不显著(P>0.05)。依据检测时选择的内参基因将纳入的研究分组,分为以GAPDH为内参基因组和以其他基因为内参基因组,经DOR的Cochran-Q检验得到以GAPDH为内参基因组的Cochran-Q=14.13,P=0.226,DOR的I2=22.1%,以其他基因为内参基因组的Cochran-Q=1.40,P=0.705 7,DOR的I2=0.0%。

此外,根据内参基因和circRNAs表达水平不同分组进行亚组分析,结果显示,以GAPDH为内参基因组的合并SROC的AUCROC=0.868 2,Q指数=0.798 7,以其他基因为内参基因组的合并SROC的AUCROC=0.736 2,Q指数=0.682 1;而circRNAs表达上调组的合并SROC的AUCROC=0.824 4,Q指数=0.757 5,circRNAs表达下调组的合并SROC的AUCROC=0.869 8,Q指数=0.800 2。

2.5敏感性及发表偏倚检验

2.5.1敏感性分析 为检验本次研究结果的稳定性与可靠度,选择StataMP 14.0对纳入研究的数据进行敏感性分析,结果显示只有2篇原始研究存在较强敏感性,而其他原始研究不会造成运算结果的敏感。剔除敏感性较强的原始研究再进行分析,合并敏感性、合并特异性、合并SROC曲线下面积变化不大,本次研究结果比较稳定。

2.5.2发表偏倚检验 通过应用StataMP 14.0软件绘制Deeks漏斗图与Galbraith图检验发表偏倚,结果显示,Deeks漏斗图斜率系数P=0.79,提示纳入研究不存在发表偏倚;Galbraith图显示存在非阈值效应引起的异质性,但大部分原始研究均落到可信区间回归直线的内部,异质性小,表明纳入研究的结果有可靠度。见图5。

注:A,Deeks 漏斗图;B,Galbraith 图。图5 异质性及发表偏倚检验结果

3 讨论

相比传统的组织活检,液体活检操作简单、创伤小、成本低,其中血液是更具优势的液体活检标本[24]。而circRNA能稳定存在于外周血循环、脑脊液、尿液等体液中,在不同的生理和病理状况下均可检测到特定circRNAs的差异表达[3]。应用外周血循环circRNAs作为新型液体活检标志物的研究前景更广阔。越来越多研究表明外周血循环circRNAs具有良好的诊断肺癌效能。如Luo等[25]提出,circFOXP1在NSCLC患者的血清中呈显著过表达,并且稳定性试验的Ct值在极端条件下保持稳定,血清circFOXP1作为NSCLC新的临床标志物具有巨大的潜力。可见,外周血循环circRNAs关于肺癌的诊断价值研究将成为肺癌诊断研究的最理想的新方向。

本次研究通过Meta分析显示,外周血循环circRNAs诊断肺癌的合并敏感性、合并特异性、合并SROC曲线下面积均较高,提示外周血循环circRNAs对肺癌有较高的诊断价值,并且表达上调和表达下调的外周血循环circRNAs诊断肺癌的SROC曲线下面积相差不大,说明表达上调和表达下调的外周血循环circRNAs对肺癌的诊断价值相当。Meta回归与亚组分析提示,内参基因的选择是引起非阈值效应异质性的显著影响因素,而发表时间、样本类型、样本数量、病理类型、circRNAs表达、qRT-PCR试剂公司对本研究结果异质性的影响不显著;以GAPDH为内参基因组研究的外周血循环circRNAs对肺癌的诊断价值大于以其他基因为内参基因组。在临床检验工作中,目前circRNAs的相对表达量主要通过2-ΔΔCt法进行计算,内参基因的稳定性及其与靶基因扩增效率的一致性直接影响了试验结果的准确性。随着数字PCR技术的发展与普及,采用绝对定量方法检测circRNAs在外周血中的表达情况可能成为液体活检的发展趋势。此外,纳入研究的文献中肺癌患者临床病理参数分析结果显示,不同的外周血循环circRNAs差异表达与肺癌患者的淋巴结转移、肿瘤大小及预后等临床病理参数相关。

综上所述,外周血循环circRNAs具有较大潜力作为诊断肺癌的候选生物学标志物。但此次研究存在以下局限性:(1)纳入研究的文献数量较少,而且多数为小样本的病例研究,会影响研究结果的准确性;(2)纳入研究的病例资料不全,没有根据患者年龄、性别、肺癌分期等因素进行全面的Meta回归和亚组分析,不能更准确地探讨异质性来源和减少异质性。今后还需继续进行大规模、多中心、前瞻性的高质量循证临床研究进一步验证上述结果的真实性和可靠性,明确外周血循环circRNAs作为肺癌诊断标志物的临床价值,以期找到诊断肺癌的最佳外周血循环circRNAs标志物。