1例无创产前检测提示13-三体综合征与21-三体综合征同时高风险胎儿的产前诊断

张颖,王皖骏,段红蕾,李洁(南京大学医学院附属鼓楼医院产前诊断中心,南京 210008)

无创产前检测(noninvasive prenatal testing,NIPT)是通过提取孕妇外周血中胎儿游离DNA,对其进行测序及生物信息学分析,最终实现对胎儿染色体非整倍体患病风险进行评估[1-2]。NIPT因其敏感性高、特异性高、无创等优点已在临床上广泛应用。近年随着测序深度的增加及生物信息学算法的优化,NIPT不仅实现了对胎儿常见染色体非整倍体(21、18 和13号染色体)的筛查,还被扩展到其他染色体非整倍体及染色体微缺失/重复综合征(microdeletion/microduplication syndrome,MMS)的筛查[3],即扩展性NIPT。本研究对1例无创产前检测提示13-三体综合征、21-三体综合征同时高风险的孕妇进行产前诊断及家系分析,为临床遗传咨询提供参考。

1 对象与方法

1.1研究对象 孕妇,23岁,孕1产0,自然妊娠孕17周,单胎,早孕超声显示胎儿颈项透明层厚度(nuchal translucency,NT)2.4 mm。孕妇门诊自愿要求进行NIPT以评估胎儿常见染色体病患病风险,并签署知情同意书。NIPT报告提示13-三体综合征、21-三体综合征同时高风险,经遗传门诊咨询后,行羊水穿刺进行胎儿染色体微阵列分析,孕妇及其丈夫同时采集外周血进行染色体核型分析。本研究通过南京鼓楼医院伦理委员会批准(批准文号:2022-120-02)。

1.2主要仪器与试剂 高速冷冻离心机(美国ThermoFisher公司),Qubit 2.0核酸定量仪(美国ThermoFisher Scientific公司),荧光定量PCR仪(美国ABI STEPONE PLUS公司),NextSeq CN500基因测序仪(美国Illumina公司),分析软件为ChAS4.0 GLS-120全自动染色体核型分析系统(德国Leica公司),GE Voluson E10彩色多普勒超声诊断仪(美国GE公司),配备腹部凸阵探头(3～5 MHz)。

血浆游离DNA提取试剂盒,胎儿染色体非整倍体检测试剂盒,测序反应通用试剂盒均购自杭州贝瑞公司。CMA芯片AITymetrixCytoScan750K(美国ThermoFisher公司),外周血染色体培养基、羊水染色体培养基(广州白云山公司)。

1.3方法

1.3.1NIPT及扩展性NIPT 使用EDTA-K2抗凝管采集孕妇外周血10 mL,4 h内冷冻离心机1 600 r/min 10 min、普通离心16 000 r/min 10 min后分离血浆,保存于-20 ℃。提取血浆游离DNA,并且对提取的血浆游离DNA浓度进行检测。文库构建和纯化后,利用荧光定量PCR仪进行文库定量。采用基础性、扩展性NIPT样本混合上机测序方式,扩展性NIPT样本的DNA文库上机量为普通NIPT的5倍。使用NextSeq CN500 测序仪及配套试剂盒进行DNA测序[4]。

1.3.2羊水染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis, CMA) 知情同意后,由妇产科医生于孕17周在超声引导下行羊膜腔穿刺术,采集羊水10 mL。基因组DNA提取、CMA实验及分析、验证流程按本中心常规操作流程进行[5]。拷贝数变异(copynumbervariariations,CNVs)的性质主要依据ClinGen2019年颁布的指南,报告原则为:(1)在具有重要临床意义的区域,DNA拷贝缺失>100 kb;(2)在已知具有重要临床意义的区域外,连续DNA拷贝缺失达 500 kb以上或连续拷贝重复达1 Mb以上(在这些区域内的探针密度达到每100 kb具有20个以上探针,同时存在1个在线人类孟德尔遗传基因)。

1.3.3外周血染色体核型分析 使用肝素钠抗凝管采集外周血3 mL,采用常规方法细胞培养、收获、制片、G显带,染色体分辨率为450～550条带,每份标本计数20～50个中期分裂相,分析3～5个核型,按人类染色体国际命名系统(ISCN 2016) 描述核型。

1.3.4NIPT质量控制管理及结果判断判断标准[6]胎儿游离DNA比例>3%,下机数据Q30≥85%,36.5%1.5 Mb,扩展性 NIPT 单个样本唯一比对序列数据量>10 Mb,为质控合格。Z>3为重复或三体型高风险,Z<-3为缺失或单体型高风险。CNVs拷贝数>2.4判断为母源性重复,拷贝数<1.6判断为母源性缺失。

2 结果

2.1NIPT结果 胎儿游离DNA浓度(cell-free fetal DNA,ffDNA)19.5%,有效数据量为2.4 Mb,室内质控Q30显示93.8%,GC含量为40.07%,结果提示13-三体综合征和21-三体综合征同时高风险,分别为(Z13:8.62)(Z21:6.48),考虑到21-三体综合征、13-三体综合征同时发生的可能性较低,采用扩展性NIPT对剩余血浆样本进行了复检。扩展性NIPT结果显示,胎儿游离DNA浓度为18.5%,有效数据量为11 Mb,约为普通NIPT的5倍,室内质控Q30显示94.8%,GC含量39.69%,结果提示该病例同时为13号染色体部分三体及21号染色体部分三体同时高风险,分别为(Z13:8.98)(Z21:4.78),具体重复片段位置为13q14.2-q34,21q11.2-21.3。见图1、2。

注:数据量明显升高,Z值大于3提示有重复。图1 扩展性NIPT 21号染色体数据结果

注:数据量明显升高,Z值大于3提示有重复。图2 扩展性NIPT 13号染色体数据结果

2.2胎儿羊水染色体微阵列结果 羊水染色体微阵列结果提示13号染色体和21号染色体重复,具体为13q14.2q34(50646848-114342258)×363.7 Mb,21q11.2q21.3(13644166-26035771)×312.4 Mb,结果和NIPT及扩展性NIPT结果显示一致。

2.3胎儿父母外周血染色体结果 经外周血染色体核型细胞培养后,G显带显示胎儿父亲外周血染色体核型为46,XY,胎儿母亲外周血染色体核型显示46,t(13,21)(q14.3, q11.2),为染色体平衡易位携带者。见图3。

注:红框显示胎儿母亲发生易位的片段。图3 胎儿羊水CMA结果及胎儿母亲外周血染色体核型

3 讨论

NIPT以检测21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征等疾病为主要目标,具有99%的特异性和敏感性[7],尽管如此,母体染色体异常、限制性胎盘嵌合体、胎儿游离DNA 浓度过低、多胎妊娠等均可能影响NIPT的结果,产生假阴性和假阳性[8]。扩展性NIPT是通过加深测序深度并提高生物学信息算法增加了检测范围,使得CNV的检出率明显提高。Liang 等[9]2019年用扩展性NIPT对 94 085例单胎妊娠妇女的外周血样进行非整倍体和全基因组MMS筛查,结果显示对二者均取得了较高的阳性预测值。

本文中孕妇无创产前检测结果显示13号染色体和21号染色体Z值同时大于3,考虑到胎儿同时为21-三体综合征和13-三体综合征的风险较为罕见,我实验室利用剩余血浆样本进行了扩展性NIPT的检测,结果提示胎儿为13号染色体部分三体及21号染色体部分三体高风险。充分告知孕妇及家属后,该病例接受了介入性产前诊断,羊水染色体微阵列检测结果提示13q14.2q34(50646848-114342258)×363.7 Mb,21q11.2q21.3(13644166-26035771)×312.4 Mb ,重复片段大小和位置与NIPT及扩展性NIPT结果一致。胎儿同时存在21、13部分三体,提示父母存在平衡易位携带者可能。通过夫妻外周血染色体检测,结果显示孕妇本人为21、13号染色体平衡易位携带者。

大量研究证实,三体中额外的1条染色体 90% 来源于母亲,多是由于卵母细胞在第1次减数分裂时发生错误而形成[10]。由于孕妇为非同源染色体相互易位携带者,不会引起明显遗传效应,故表型正常,但由于存在13号和21号染色体的易位,在减数分裂中,根据不同的分离方式可形成18种类型的配子,与正常的精子结合形成18种合子,其中1/18为正常者,1/18为平衡易位携带者,其余16/18均为部分三体、部分单体或单体、单体合并三体型患者,导致流产、畸胎、死胎及异常染色体患儿的出生。染色体平衡易位携带者生育时可选择辅助生殖技术进行植入前诊断或自然受孕后在孕期行产前诊断,降低生育患儿风险。

对于普通NIPT有特殊提示或者罕见提示的样本,扩展性NIPT在染色体片段重复/缺失的检测上提供更多的遗传变异信息;但是对于NIPT有特殊提示的孕妇应进行产前诊断进一步明确遗传学病因,对于有需要的病例可进行家系分析,有利于后续遗传咨询及产前诊断的开展。