梨矮化砧木中矮4 号组培快繁技术研究*

叶 宇，欧春青，王 斐，张艳杰，马 力，李舒然,2，刘亚龙，姜淑苓

（1 中国农业科学院果树研究所，农业农村部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城 125100）（2 沈阳农业大学园艺学院）

梨（PyrusL.）是世界性的重要落叶果树，因其果实香脆多汁、酸甜可口，具有较高的营养价值和医疗保健作用，深受人们的喜爱，被誉为“百果之宗”。传统梨园在生产上普遍采用稀植大冠或乔砧密植栽培模式，存在树体过大、树势过旺、通风透光差、结果晚、果品质量差、管理困难等问题[1-2]。矮砧集约化密植栽培具有树体矮化、早果丰产、品质优良、管理方便、经济效益高等优点，能够弥补传统栽培模式的不足，是我国梨栽培发展的必然趋势[1,3]。中矮4 号是中国农业科学院果树研究所从锦香梨实生后代中选育而成的梨矮化砧木新品种，具有嫁接亲和性好、矮化效果显著、抗枝干腐烂病和轮纹病、抗寒性强等优点[4]，在梨矮化密植栽培中发挥着重要作用。由于中矮4 号枝条短、扦插生根困难，在生产上仅用作中间砧，苗木繁育效率低且生产成本高，尚没有自根砧的应用，严重制约了其推广速度。

采用组织培养的方法繁殖，不仅能够保存、提纯和复壮母本的优良性状，还能消除季节因素的限制，从而显著地提升繁殖效率，满足短期大规模生产的需要，创造巨大的经济价值，是果树无性繁殖常用的方法之一[5]。目前，关于梨砧木组培快繁技术研究的报道较少，仅在杜梨[6-7]、豆梨[8]和个别矮化砧木[9-10]上有少量报道。本研究以中矮4 号带芽茎段为试验材料进行组织培养研究，通过对增殖继代和生根培养基配方的筛选，为其建立简便、高效的组培快繁技术体系，以期为中矮4 号自根苗的工厂化繁育提供技术支撑，也为其基因工程改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究的试验材料中矮4 号保存在中国农业科学院果树研究所梨育种试验园内，为嫁接在杜梨基砧上10 年生以上的大树。

1.2 试验方法

1.2.1 初代组培苗的获得

春季于中矮4 号新梢萌发长至10 cm 左右时，采集其新梢，剪掉新梢上的叶片，保留叶柄，剪成单芽茎段，用自来水冲洗干净，经70%乙醇处理30 s、0.1% HgCl2溶液处理10 min、无菌水清洗5 次后，接种至MS＋0.3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IAA＋1.0 mg/L GA3＋30.0 g/L 蔗糖的初代培养基上，于25 ℃、光照16 h、黑暗8 h 的组培室进行培养。待芽萌发长至2～3 cm 时，剪下进行继代培养。

1.2.2 不同浓度6-BA 对组培苗增殖的影响

以MS 为基本培养基，添加0.3 mg/L IAA、3.0 mg/L GA3和30.0 g/L 蔗糖，然后分别添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 的6-BA，共5 个处理，每个处理3 瓶，每瓶接种3 个外植体，3 次重复。培养条件同初代培养，30 d 后测量株高，调查组培苗增殖系数，并观察组培苗生长状况。

增殖系数＝培养后外植体数/初始外植体数

1.2.3 不同硅源及浓度对组培苗增殖的影响

以MS 为基本培养基，添加1.0 mg/L 6-BA、0.3 mg/L IAA、3.0 mg/L GA3以及30.0 g/L 蔗糖，然后分别附加50、100、200、400、800 mg/L 的纳米二氧化硅（NS）和硅酸钾（KS），以不添加硅源处理为对照，共11 个处理，每个处理3 瓶，每瓶接种3个外植体，3 次重复。培养条件同初代培养，30 d后测量株高，调查组培苗增殖系数，并观察组培苗生长状况。

1.2.4 不同生根方法对组培苗生根的影响

生根培养采用一步生根法和两步生根法[11]。

（1）一步生根法。选取高度大于2.5 cm 且长出3 片及以上叶片的组培苗，以1/2MS＋15.0 g/L 蔗糖为基本培养基，分别添加0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0 mg/L 的IBA，共6 个处理，每个处理5 瓶，每瓶接种3 个外植体，3 次重复。培养条件同初代培养，30 d 后调查生根指标，包括生根率、平均根数、平均根长、平均根粗。

生根率（%）＝（生根株数/接种株数）×100

（2）两步生根法。选取高度大于2.5 cm 且长出3 片及以上叶片的组培苗，以1/2MS＋15.0 g/L 蔗糖为基本培养基，分别添加2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的IBA，分别暗培养3、5、7 d，然后转移至1/2MS＋1.0 g/L 活性炭（AC）＋15.0 g/L 蔗糖的培养基中，共12 个处理，每个处理5 瓶，每瓶接种3 个外植体，3 次重复。培养条件同初代培养，培养30 d 后调查生根指标。

1.2.5 炼苗与移栽

当组培苗生根培养30 d 后，根系长度1～2 cm时进行炼苗。将组培苗从组培室转移到温室，打开瓶口约1/3 炼苗3 d，然后完全打开瓶盖炼苗2 d。清洗组培苗根部培养基，移栽至培养基质为草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝1∶1∶1 的育苗穴盘中，浇透水，喷施50%多菌灵可湿性粉剂800～1 000 倍液，然后扣膜或加盖保湿。移栽15 d 后，逐渐打开覆膜或盖子继续培养，并及时补水，移栽30 d 后统计成活率。

1.3 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2020 软件处理数据及制表，采用SAS 9.4 M5 版软件进行数据统计分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 中矮4 号组培苗的初代培养

中矮4 号单芽茎段在初代培养基上，7 d 内有15%左右的茎段出现了不同程度的细菌或真菌污染，未污染的茎段更换新的培养基，接种培养40 d后，90%以上的未污染茎段上长出了幼嫩新梢，成功获得了中矮4 号组培苗。

2.2 不同浓度6-BA对中矮4号组培苗增殖的影响

由表1 可以看出，不同浓度6-BA 对中矮4 号的增殖和外植体生长状态产生明显影响。当6-BA浓度为1.0 mg/L 时，组培苗的株高达到最高，为3.65 cm，生长健壮，随着6-BA 浓度的升高（1.5～2.5 mg/L），组培苗的株高呈下降趋势。组培苗的增殖系数随着6-BA 浓度的升高呈先上升后下降的趋势，在6-BA 浓度为2.0 mg/L 时，达到最大值，为3.71，但组培苗矮小。可见在一定浓度范围内（0.5～2.0 mg/L），较低浓度的6-BA 有利于中矮4 号组培苗长高，而较高浓度的6-BA 则有利于中矮4 号组培苗的增殖。综合组培苗的生长和增殖状况可知，1.0 mg/L 为适宜中矮4 号组培苗增殖培养的较好6-BA 浓度。

2.3 不同硅源及浓度对中矮4 号组培苗增殖的影响

由表2 可以看出，不同浓度的NS 和KS 可对中矮4 号组培苗的增殖产生显著影响。组培苗的株高和增殖系数均随NS 浓度的升高呈先上升后下降的趋势，株高、增殖系数最高的NS 浓度分别为100 mg/L 和200 mg/L，均显著高于对照。KS 对中矮4号组培苗生长的影响与NS 略有不同，株高随着KS浓度的升高总体呈现下降趋势，增殖系数则与之相反，株高、增殖系数最高的KS 浓度分别为50 mg/L和400 mg/L，也均显著高于对照，但均显著低于NS的最佳处理。结合各处理组培苗的生长状态可知，200 mg/L NS 处理，不仅植株生长健壮，且增殖系数高（5.67），增殖系数分别比对照和最佳KS 处理（400 mg/L）提高了62.00%和20.38%，最有利于中矮4号组培苗的增殖和生长。

表2 不同硅源及浓度对中矮4 号组培苗增殖的影响

2.4 不同生根方法对中矮4 号组培苗生根和移栽的影响

一步生根法中不同浓度的IBA 对中矮4 号组培苗生根的影响有差异（表3）。组培苗在生根培养7～8 d 后，其茎基部开始有白色物质长出，培养15～20 d 后有白色幼根生成。当IBA 为0.25、0.50 mg/L 较低浓度时，组培苗的生根率较高，以0.50 mg/L IBA 处理最高，为83%，这2 个处理间差异不显著；随着IBA 浓度的进一步升高，组培苗的生根率呈逐渐下降趋势。同时，低浓度的IBA（0.25、0.50 mg/L）也有利于组培苗形成较多、较长和较粗的根系。由此可见，0.50 mg/L 是中矮4 号组培苗一步生根法的最佳IBA 浓度。

表3 一步生根法对中矮4 号组培苗生根的影响

在两步生根法中，IBA 浓度和暗培养时间均对中矮4 号组培苗的生根效果有显著影响（表4），各处理的生根率在29%～92%，平均单株根数为2.3～11.2 条，平均根长为1.46～3.98 cm，平均根粗为0.33～0.38 mm。其中，IBA 浓度为3.0 mg/L 时，组培苗的生根效果最好，暗培养3～7 d 处理均能使其生根率在83%以上，以暗培养5 d 效果最好，生根率为92%，平均单株根数为11.2 条。无论哪个IBA浓度处理，暗培养5、7 d 的效果均好于暗培养3 d，整体来看，暗培养5 d 的效果最好。因此，对于中矮4 号组培苗两步生根法，最佳的处理为1/2MS＋3.0 mg/L IBA＋15.0 g/L 蔗糖暗培养5 d。

表4 两步生根法对中矮4 号组培苗生根的影响

综上所述，对于中矮4 号组培苗，一步生根法和两步生根法均能诱导组培苗生根。相比于一步生根法，两步生根法处理的组培苗生根效果更好，其生根率、平均单株根数和平均根长均明显优于一步生根法，但是一步生根法诱导的根系平均根粗要大于两步生根法。通过对生根的组培苗进行炼苗移栽（图版3），其移栽存活率均在90%以上，从生根率上看，两步生根法优于一步生根法。

3 讨论

植物生长调节剂种类及配比对梨组培苗的诱导分化、增殖和生根起到关键性的作用，主要包括生长素类、细胞分裂素类以及赤霉素类等[5]。细胞分裂素通常与生长素一起使用，两者相辅相成能够起到更好的培养效果[12-13]。一般来说，细胞分裂素与生长素的比值较高，则有利于促进不定芽形成，扩大增殖系数。另外，GA3对芽的增殖和伸长有一定的促进作用，与生长素和细胞分裂素组合使用能够取得较好的效果[14]。本试验在IAA 和GA3浓度固定的条件下，组培苗的增殖系数随着6-BA 浓度的升高呈先上升后下降的趋势。过高浓度的6-BA 会导致组培苗生长状态变差，在一定浓度范围内，较低浓度的6-BA 有利于组培苗株高的形成，而较高浓度的6-BA 则有利于组培苗的增殖，这与王苏珂等[15]、杨冠宇等[6]的研究结果基本一致。

硅是土壤中含量最丰富的矿物元素之一，也是大多数高等植物生长的有益元素。作为一种宏量元素，硅对植株生长状况的改善效果极为显著，能够促进多种植物（包括硅非积累型植物）的生长发育、改善植株形态以及提高植株抗逆性等[16-17]。近年来，许多学者关注到硅在组织培养中的作用并进行相关试验，研究结果表明，在培养基中加入硅可以促进愈伤组织生长、器官发生，并改善植株的形态、解剖、生理特征，从而促进组培苗的生长发育[18]。目前，硅已应用于苹果[19]、香蕉[20]、草莓[21]、蓝莓[22]等果树组织培养中，但尚未有在梨中应用的报道。本试验在筛出最佳的中矮4 号组培苗增殖培养配方基础之上，研究不同浓度的纳米二氧化硅（NS）和硅酸钾（KS）对组培苗增殖的影响，证明了硅能够提高梨组培苗的增殖效果，NS 的效果好于KS，可能是NS 更有利于组培苗的吸收利用，关于硅对梨组培苗生理代谢以及生根诱导方面的影响还有待进一步研究。

梨属植物组培苗生根困难，生长素类物质是不定根诱导所必需的，其种类和浓度都会对组培苗的生根效果产生影响[5]，目前生产上应用最多的生根诱导剂主要是IBA。本试验中，中矮4 号组培苗一步生根法使用0.50 mg/L IBA 的生根效果较好，浓度过高反而不利于组培苗生根，这与罗嘉亮等[23]的研究结果一致。另外，光照条件和培养方法对组培苗不定根诱导也有影响，前期的暗培养对组培苗的生根诱导具有促进作用[24]，而活性炭（AC）可吸附植株分泌的有害物质，同时提供生根的暗环境有利于根的诱导和根系生长[25]。本研究采用两步生根法暗培养5 d 后，转入1.0 g/L AC 的培养基中，组培苗的生根率可达92%，而暗培养时间过短则不利于组培苗生根[7]。

利用矮化砧木是实现梨矮化密植集约栽培的主要途径，而组织培养技术是实现梨自根砧无性繁殖的有效技术之一，可在短时间内获得大量再生植株并保留其优良性状，同时可通过组培苗脱毒技术获得无毒苗木，为梨产业提供大量优质苗木。本研究通过对中矮4 号的组织培养，获得了增殖系数最大为5.67 的增殖培养基配方和生根率最高为92%的生根培养基配方，建立了简便、高效的梨矮化砧木组培快繁技术体系，为其自根苗工厂化繁育提供了技术支撑。

4 结论

以带芽茎段为试材，获取梨矮化砧木中矮4 号的组培苗较为容易；组培苗在MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IAA＋3.0 mg/L GA3＋30.0 g/L 蔗糖上增殖生长较好，增殖系数为3.29，在该培养基上再添加200 mg/L NS，增殖效率可提高72.34%，增殖系数达5.67；最佳生根培养基配方为1/2MS＋3.0 mg/L IBA＋15.0 g/L 蔗糖暗培养5 d 后，转移至1/2MS＋1.0 g/L AC＋15.0 g/L 蔗糖的培养基中，生根率达92%，平均单株根数为11.2 条。