槟榔碱细胞毒性及其作用机制研究进展

胡 晨，张昊芃，张晓朦，张烁颖，胡晓艳

（1.西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000； 2.西南医科大学病原生物学教研室，四川 泸州 646000）

随着我国经济快速发展，人们生活压力逐渐增大，咀嚼槟榔已成为一种常用的提神醒脑方式。槟榔为棕榈科常绿乔木槟榔的种子，可以药食两用，原产于马来西亚，主要分布于南亚、东南亚国家及我国台湾、福建、广东、广西等地。我国已有两千多年的槟榔用药史，《本草纲目》记载其“通关节，利九窍，补五劳七伤，健脾调中，除烦，破症结”。现代药理学发现，槟榔具有抑菌、驱虫、促胃肠道消化运动、抗肿瘤等药理作用［1-5］。如今，由于食用槟榔人数的增加和现象的普遍，其导致的一系列疾病也备受重视。

槟榔化学成分复杂，含有多种生物碱，包括槟榔碱、槟榔次碱、甲基槟榔碱等［6］，其中槟榔碱含量最高，为主要药理和毒性成分［7］。槟榔碱是一种有机物，化学式C8H13NO2，临床用于治疗青光眼、产后子宫出血等症。长期咀嚼所释放出的槟榔碱可以诱发口腔黏膜下纤维化、心血管病变、高血压、肾脏损伤等，甚至致癌［8-9］，且深入研究发现，槟榔碱具有很强的细胞毒性，内皮、成纤维、上皮等细胞为其主要作用靶点，除表现抑制细胞增殖、促使细胞凋亡的共同影响外，槟榔碱对不同细胞的毒性作用存在一定的差异。本文将槟榔碱主要的细胞毒性及可能的作用机制进行综述，以期为期深入研究提供依据。

1 对内皮细胞的毒性作用

内皮细胞存在于血液与血管平滑肌之间，具有局部血管调节作用。Tseng 等［10］研究了槟榔碱对人脐静脉内皮细胞的毒性作用，MTT 结果表明，0.8 mmol/L 槟榔碱作用24 h后能够抑制细胞增殖，细胞数量减少31%，具有量效和时效依赖关系，随剂量的增加，细胞收缩程度升高，G0/G1期、S 期占比分别降低14.1%、9.4%，G2/M 期细胞增加19.3% （P＜0.05），推测是由于槟榔碱能够阻断细胞分裂间期的物质准备，从而阻碍DNA 的复制和相关蛋白的合成，使细胞无法完成增殖。靳婷［11］将大鼠细胞暴露于高浓度槟榔碱24 h 后，发现细胞活性降低，出现细胞凋亡的典型形态学改变，细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3） 水平升高，提示槟榔碱可诱导细胞凋亡，且caspase-3 可能在槟榔碱诱导的细胞凋亡中起重要作用。

槟榔碱对内皮细胞的毒性还可能与细胞内谷胱甘肽转化酶（glutathione S-transferase，GST） 活性有关，GST 是维持细胞氧化还原稳态的重要组成部分。Shakya 等［12］对果蝇体内槟榔碱的毒性评估实验表明，果蝇体内GST 活性降低，当槟榔碱浓度为0.02、0.04、0.08 mmol/L 时，幼虫中GSH 活性分别降低1.36、1.60、1.80 倍，氧自由基（oxygen free-radicals，OFR） 水平升高（P＜0.05）。可能是胞内谷胱甘肽损耗，OFR 的产生和清除之间的平衡遭到破坏，使线粒体膜通透性增大，细胞能量代谢活力降低，ATP 生成减少，促使细胞凋亡。Wu 等［13］研究槟榔碱对内皮细胞的作用，发现槟榔碱可引起血管内皮细胞胞内诱导型一氧化氮合酶活性升高，刺激NO 过度分泌导致血管内皮扩张，血管稳态失衡。

综上所述，槟榔碱作用于内皮细胞后，造成细胞形态学的改变，血管内皮的损伤，细胞内OFR 水平的升高，凋亡相关蛋白的激活，影响凝血、物质转运等功能障碍。

2 对上皮细胞的毒性作用

上皮细胞位于皮肤或腔道表层，具有保护、吸收、分泌等功能，进入体内的槟榔碱很容易损伤上皮细胞。将浓度为0.15、0.3 mmol/L 的槟榔碱分别作用于上皮细胞48 h后发现，细胞活力分别降低22%、30%，细胞收缩成纺锤形或圆形，细胞间隙变大，大量细胞溶解，并存在量效依赖性（P＜0.05）［14］。这一结果与Ren 等［15］研究结果一致，槟榔碱可促使转化因子SAA1、IL-6、IL-36G 水平升高，使上皮间充质转化相关分子表达异常，导致细胞极性丧失，细胞间连接方式被破坏。Shih 等［16］用0.4 mmol/L 槟榔碱染毒正常前列腺上皮细胞48 h 后，发现除细胞形态学改变外，槟榔碱能抑制上皮细胞的活性，G1期和S 期细胞占比降低。口腔黏膜下纤维化的特征之一是上皮细胞的萎缩，Li 等［17］利用口腔角质细胞进行槟榔碱的毒性研究，结果表明，0.16 mmol/L 槟榔碱能抑制细胞生长，细胞骨架蛋白关键基因TPM1 表达降低，而敲除TPM1 削弱了槟榔碱对细胞生长的影响，因此可推论TPM1 是导致细胞毒性的原因之一，也是治疗口腔黏膜下纤维化的重要靶点。Voigt等［18］发现，槟榔碱可与脯氨酸竞争性的结合人质子偶联氨基酸转运蛋白1，从而减少肠上皮细胞对脯氨酸的摄取，抑制细胞生长。而Lin 等［19］进行小鼠体内实验表明，槟榔碱对细胞活力没有影响，但剂量依赖性地升高肾皮质纤连蛋白和纤溶酶原激活剂抑制蛋白表达，诱导小鼠肾小管间质纤维化，提示咀嚼槟榔可增加肾纤维化的发生风险。此外，Uehara 等［20］将0.3 mmol/L 槟榔碱作用于人类牙龈上皮细胞30 d 后与同时期阴性对照组比较，发现槟榔碱组细胞活性降低，基质金属蛋白酶9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 活性升高。MMP-9 活性升高可导致牙龈上皮细胞衰老，使上皮细胞获得侵袭、转移能力［21］，为槟榔碱致癌的潜在机制提供参考。综上所述，上皮细胞毒性反应因来源或部位而异，在一定条件下为患者个体化治疗提供了可能，但目前缺乏体内的实验，且不排除其他因素可能的协同作用，仍有待进一步研究。

槟榔碱能够引起细胞的凋亡，具有潜在的致癌作用。Li 等［17］将浓度为0.16 mmol/L 的槟榔碱作用上皮细胞48 h，结果显示，细胞出现明显的凋亡现象，这可能与TPM1 表达降低和caspase 活性升高有关。这在张睿等［22］的研究结果得到了验证，槟榔碱可诱导凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8 （外源性凋亡途径的主要蛋白）、caspase-9（内源性凋亡途径的相关蛋白） 表达升高。但未发现caspase-9 有剂量依赖性［23］，表明槟榔碱主要以外源性途径诱导细胞凋亡。但目前未见槟榔碱对于上皮细胞安全剂量的探讨，这也是深入研究的方向之一。

3 对成纤维细胞的毒性作用

成纤维细胞主要参与胶原的合成、降解、吞噬。体外研究发现，槟榔碱能影响成纤维细胞增殖、合成胶原蛋白等［24］。低剂量槟榔碱（浓度＜0.1 mmol/L） 能升高分泌型糖蛋白Wnt5a 表达来促进人口腔成纤维细胞的增殖［25］，但高剂量槟榔碱（浓度＞0.2 mmol/L） 却会使细胞活力降低，细胞增殖受到抑制［26］。表明槟榔碱对成纤维细胞增殖的影响可能与使用剂量和细胞耐受程度有关。此外，Ku 等［27］在进行大鼠体内槟榔碱毒性研究时发现，与对照组比较，槟榔碱促使胶原蛋白在上皮组织下过度沉积，致使心脏纤维化，且转化生长因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 表达升高约1.7 倍。推测TGF-β1 的高表达是槟榔碱促使胶原积累、产生细胞的毒性的重要机制。近年来研究证实，TGF-β1 是一种有效的促纤维化细胞因子，槟榔碱通过长链非编码RNA （LINC00974） 介导TGF-β/Smad信号通路刺激成纤维细胞活化［28］，激活胶原基因（COL1A2、COL3A1、COL6A1、COL6A3、COL7A1），诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化和胶原沉积［29］。Ho 等［30］和Yang 等［31］同样利用TGF-β/Smad 信号通路进行槟榔碱的毒性研究，结果表明，槟榔碱可介导TGF-β 使缺氧诱导因子-1 的mRNA、致癌基因miR-21 表达升高，促进纤维化的发生。此外，槟榔碱还可介导HIF-1α/TGF-β/CTG 通路诱导成纤维细胞中纤维相关分子（COL1A2、COL3A） 的表达，降低基质金属蛋白酶2 活性，促使异常细胞增殖和迁移［32］。综上所述，槟榔碱能有效调节细胞因子增加细胞内胶原蛋白的合成，这可能是槟榔碱诱发口腔黏膜下纤维化的原因之一。

4 对神经细胞的毒性作用

自噬参与蛋白质和细胞器的分解，在维持细胞内环境稳态中起重要作用，有利于细胞清除外来毒性物质［33］。Gao 等［34］研究发现，2 mmol/L 槟榔碱可升高PC12 细胞自噬相关分子LC3 Ⅱ/LC3I 的比值和p62 蛋白表达，降低PC12 细胞的自噬作用。Jiang 等［35］将槟榔碱暴露于PC12细胞24 h 后发现细胞内Bcl-2 蛋白（抗凋亡蛋白） 表达降低，Bax 蛋白（促凋亡相关蛋白） 表达升高，且Bcl-2、Bax 等进入线粒体后促使线粒体膜释放细胞色素C，激活caspase 级联反应，最终导致细胞凋亡。同时小鼠耳蜗组织外植体实验研究证明，槟榔碱能剂量依赖性地降低超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽水平，抑制细胞抗氧化能力，产生活性氧和活化NADPH 氧化酶等酶类，导致神经元内氧化还原反应失衡及感觉神经性听力障碍［36］。因此，槟榔碱对于神经细胞的毒性作用多面性大大提高了神经疾病的发生率。

据报道，槟榔碱是世界上第四大最常用的人类精神活性物质（仅次于酒精、尼古丁、咖啡因），对中央和周围神经系统也有一定的影响，长期食用会导致成瘾、出现沮丧、焦虑、注意力不集中、乏力等戒断反应［37-38］。Liu等［39］初步推测槟榔碱可能具有M 胆碱、拟副交感神经毒性。这在Siregar 等［40］的研究得到证实，槟榔碱能与毒蕈碱、乙酰胆碱受体对接，使斑马鱼运动过度亢进。但两者广谱的结合特性［41］使得基于药理学和分子对接的方法难以获得清晰的结果，且目前槟榔碱的神经毒性研究相对较少，仅仅初步阐述了其基本毒性机制，故有待进一步研究。

5 对脂肪细胞的毒性作用

槟榔碱染毒脂肪细胞后，能改变细胞周期不同阶段的细胞分布，影响前脂肪细胞的生长［42］。Hsieh 等［43］发现前脂肪细胞因子-1 （preadipocyte factor-1，Pref-1） 作为前脂肪细胞标记物和脂肪细胞分化抑制剂，在前脂肪细胞转化为脂肪细胞的过程中，Pref-1 的mRNA 及蛋白表达降低，暴露于槟榔碱后，表达部分逆转。表明槟榔碱能在一定程度上干扰前体脂肪细胞向脂肪细胞的分化。除影响前脂肪细胞分化外，槟榔碱还会降低脂肪细胞储脂能力。凌宏艳等［44］将0.1 mmol/L 槟榔碱作用于3T3-L1 脂肪细胞后发现，细胞内脂质水平明显降低，细胞储脂功能异常。此外，丝氨酸307 磷酸化能减弱胰岛素信号传导［45］。浓度为0.1 mmol/L 的槟榔碱染毒脂肪细胞6 h 后，胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1） 丝氨酸307 磷酸化基础水平升高，阻断胰岛素介导的IRS-1 酪氨酸、脂质激酶蛋白、蛋白激酶磷酸化［44］，表明槟榔碱能通过阻断胰岛素信号传导产生胰岛素抵抗，抑制脂肪细胞的脂质储存，促进脂肪分解，升高血清中脂类水平。这为槟榔咀嚼者常患有2 型糖尿病、高脂血症、高甘油三脂血症、代谢综合症作出了合理解释。有文献报道槟榔碱可能具有潜在的降糖作用。凌宏艳等［46］将1、5 mg/kg 槟榔碱注射于2 型糖尿病大鼠后，发现大鼠空腹血糖降低，而此处理对于正常大鼠来说无影响。姚起鑫等［47］用同样的模型进行研究，指出1、5 mg/kg 为槟榔碱的安全降糖剂量，高剂量（质量浓度＞5 mg/kg） 则具有明显的细胞毒性，引起细胞水样变性，脂肪空泡，这提示槟榔碱的毒性作用与剂量有关，且可能存在着种属及机体状态的差异。但目前槟榔碱对脂肪细胞的毒性研究仍是体外实验，体内实验及对糖尿病等相关代谢疾病的影响及其机制还有待明确。

6 对生殖细胞的毒性作用

槟榔碱可损伤男（雄） 性及女（雌） 性的生殖细胞，主要体现在氧化应激反应的产生。Wu 等［48］给予小鼠100 mg/kg 槟榔碱，发现小鼠精子内脂质过氧化，抗氧化酶、唾液酸水平降低，从而损害精子数量和活性，影响精子顶体反应与受精能力。这与Li 等［49］对女（雌） 性生殖细胞毒性机制的研究结果相似，将处于生发囊泡阶段小鼠卵母细胞和1、1.15、1.2 mmol/L 槟榔碱溶液共同培养，发现槟榔碱量效依赖性地破坏线粒体完整性，引起ATP 产生的减少和活性氧合成的增加，影响肌动蛋白分布及提高染色体排列异常的发生率，抑制小鼠卵母细胞的减数分裂成熟，导致卵母细胞凋亡。这一作用会降低生殖细胞的质量和数量，影响精卵识别和受精过程，最终可能导致生殖困难甚至不孕不育。而氧化应激的产生进一步诱导炎症细胞因子（COX-2、TNF-α、IL-6 等） 的释放。槟榔碱能够升高COX-2 表达，介导炎症反应，破坏负责鞭毛运动的结构，进而降低精子运动能力［50］。Kuo 等［51］研究表明，槟榔碱剂量依赖性地诱导TNF-α 高表达，减少或重排细胞连接蛋白，破坏血-睾屏障，进一步导致精子数量与活动力，受精能力降低。且女性长期咀嚼槟榔会减少妊娠早期胚胎的植入，抑制胚泡滋养细胞生长，出现早产、流产等症状，并影响胎儿后续生长，所生婴儿大多表现为体重过轻和发育不良［52-53］。然而，有关槟榔或槟榔碱对生殖细胞的毒性机制目前仍相对缺乏，且槟榔碱对生殖细胞的直接毒性或其他作用机制还有待研究。

7 结语

槟榔碱作为传统中药槟榔的有效成分之一，具有许多药理作用。然而，槟榔碱也对多种细胞产生毒性作用，表现为细胞活性降低、细胞氧化损伤、细胞形态结构改变、细胞凋亡等，进而导致口腔黏膜下纤维化、2 型糖尿病、鳞状上皮癌、不育不孕等疾病的发生。近年来研究发现槟榔碱有许多临床治疗价值，可作为治疗多种疾病的药物。因此，研究槟榔碱细胞毒性作用及其可能存在的机制，可为临床应用提供一定的参考，同时需要更深入的研究以减少或者消除其毒性作用。