基于数据挖掘和网络药理学探析白塞病的用药规律及核心药对作用机制*

侯卫 汪宗清 王仕奇 官鑫 冯亚琼 李思泽 汤小虎,2

(1.云南中医药大学,云南 昆明 650500;2.云南中医药大学第一附属医院,云南 昆明 650032)

白塞病(behcet’s disease,BD)是属于自身免疫性疾病,以血管炎为主要病理表现,以口腔、阴部反复溃疡及葡萄膜炎为临床特征。同时,可出现心血管、消化、中枢系统的损害[1]。BD病理机制尚处于研究探索中,近年来研究发现遗传、感染、免疫等因素发挥重要的作用[2]。当前治疗主要为对症治疗,常选用非甾体抗炎药、免疫抑制药、生物制剂等,但不能完全控制血管炎症及延缓疾病进展[3],缺乏针对病因治疗有效根治方法。中医学对本病的认识始于《金匮要略》,称为“狐惑病”,“状如伤寒,默默欲眠,目不得闭,卧起不安,蚀于喉为惑,蚀于阴为狐”[4]。病机的认识源于隋《诸病源候论》:“夫狐惑二病者……此皆由湿毒气所为也。”古今医家大都认为其病机以毒邪为主,兼杂湿、热、虚、瘀等,较多选用甘草泻心汤、五味消毒饮、龙胆泻肝汤等辨证加减,且临床疗效颇佳[5]。

本研究运用中国知网、维普数据库检索关于中医药治疗白塞病的相关医案、文献,以期挖掘中医药治疗BD的用药规律及对核心药对的作用机制进行分析,将数据挖掘与网络药理学结合运用,为白塞病的防治提供参考。

1 资料与方法

1.1医案来源 本研究数据来源于中国知网、维普全文数据库。具体检索词为:“白塞病”“狐惑病”“中医”“中药”等,时间范围为2010年1月—2021年1月。

1.2纳入标准 ①中医诊断“狐惑病”,西医诊断“白塞病”,医案记录完整;②病例采用中医药治疗,中医辨证或治法明确,方剂名称、中药名称、用药剂量明确完整;③临床疗效可靠者。符合以上3条者,即可纳入本研究。

1.3排除标准 ①医案记录不完整;②动物实验;③处方药物、剂量不明确;④文章内容、病例重复者(仅纳入时间早者)。有上述任意一项者,不纳入研究。

1.4中药规范 为避免处方中以别名、采集、炮制、地区差异等不同,造成药物分析偏差,参照《中药学》[6]、《中华人民共和国药典》[7]对药物名称统一规范化,例牡丹皮、丹皮统一为牡丹皮,生甘草、炙甘草统一规范为甘草等。

1.5数据分析与处理 将筛选符合纳入标准的处方输入古今医案云平台(V 1.5.7)中医案采集模块,该软件的算法经实践证实具有科学性、可靠性。录入过程由两位研究者共同完成,对数据进行查对,以保证数据结果准确可靠。

1.6作用机制分析 将上述得到的核心药对输入中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索化学成分及作用靶点,筛选条件:口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18;GeneCards数据库以“Behcet’s disease”为检索词,获得BD的作用靶点,取BD和药对的交集靶点并输入STRING数据库,构建蛋白-蛋白互作网络,并据Degree值筛选出核心靶点,利用Cytoscape 3.6.0软件构建核心药对-活性成分-靶点-BD网络及筛选核心化合物,运用R软件对共同靶点进行KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1药物频次统计 经过筛选得到64首处方,涉及221味中药,其中使用频次以甘草54次、黄连33次、地黄31次、牡丹皮26次、当归25次排名较前,其中又以甘草的使用频次最高,占比为84.38%。其中使用频次前20的药物见表1。

2.2药物功效统计 中药的药物功效进行统计,结果以清热解毒、清热凉血、清热燥湿类排名较前。排名前5的见表2。

表2 中药功效统计(排名前5)

2.3药物药性药味统计 对纳入的221味中药进行四气统计,结果显示寒性药使用最多,药用频次292次,频率为31.91%,其次为平、微寒、温,具体结果见图1;五味统计以甘味药使用最多,药用频次455次,频率49.73%,其次为苦、辛、淡,具体见图2。

图1 药物四气统计

图2 药物五味统计

图3 药物归经频次统计

2.4药物归经统计 对纳入的中药归经进行数据统计分析。如果中药具有数个归经,全部计算在内。在221味中药里,共出现1641次归经。结果为肝经(465次,28.34%),肾经(349次,21.27%),脾经(317次,19.32%)排名较前。

2.3聚类分析 据中药处方的数量、中药数量、药物组合频次,以0.25为支持度(药对的两位中药同时出现占所有药物的比例),以0.65为置信度(药对同时出现的频率)。选择古今医案云平台的“关联分析”,结果显示药物组合14对,涉及中药10味,将药物组合按照贡献度、支持度从高到低排序(见表3)。并据支持度、提升度结果得到一核心药对:黄连-甘草。

2.4基于网络药理学探析“黄连-甘草”治疗BD的作用机制

2.4.1黄连-甘草活性成分-作用靶点网络构建 通过筛选条件,运用TCMSP数据库中共获得黄连-甘草共89个活性成分和202个潜在靶点,GeneCards数据库获得BD疾病靶点599个,映射得到53个共同靶点。通过与黄连-甘草的活性成分匹配后,共有55个具有治疗BD作用的活性成分。将55个活性成分及53个共有靶点导入Cytoscape软件,构建“黄连与甘草-活性成分-作用靶点-BD”网络,见图4。

图4 黄连与甘草-活性成分-作用靶点网络

2.4.2黄连-甘草治疗白塞病靶点蛋白互作分析 将得到的53个共同靶点基因导入STRING数据库构建PPI网络,并利用R软件选取degree排名前20的靶点绘制条形图,见图5,图中条形柱的长度代表degree的大小,由图可见白介素6(Interleukin-6,IL-6)、血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)、CC类趋化因子配体2(CCL2)、CXC趋化因子配体8(CXCL8)、细胞间黏附分子1(ICAM1)等基因排名较前,在整个网络中起着较为重要的作用,可能是黄连-甘草治疗BD的关键靶点。

图5 PPI中的核心基因(前20)

2.4.3靶点基因功能富集分析 通过KEGG分析结果显示共有106条KEGG代谢通路参与其中,筛选出富集基因数较多的前20条通路,主要涉及脂质与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)等,主要涉及炎症反应、血管细胞凋亡与免疫调节等多个环节。图6。

图6 黄连-甘草活性成分KEGG通路富集分析气泡图(前20)

3 讨论

近年来研究发现,中医药在白塞病的治疗效果颇佳,但对其具体机制研究尚有欠佳,因此需要对中医治疗白塞病具体机制进行探讨。本研究通过对中国知网及维普数据库中近10年涉及中医药治疗白塞病文献进行数据挖掘,并对高频中药进行关联规则分析,临床应用于治疗白塞病的高频中药有甘草、黄连、地黄、牡丹皮、当归等,主要功效体现为清热、解毒、凉血、燥湿等方面。研究证实清热解毒药具有抗炎、抗菌、免疫抑制等作用,其主要通过核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等信号通路发挥抗炎作用,适用于类风湿关节炎、炎性肠病等疾病[8];清热凉血药研究发现,地黄对免疫系统、血糖和血脂、抗胃溃疡等作用[9];清热燥湿药具有抗氧化、抑制免疫、抗炎等药理作用[10]。清热解毒、清热凉血、清热燥湿等中药对BD的防治主要体现为抗炎、免疫抑制、抗菌等,与BD当前研究证实的血管炎症、免疫反应等病理因素相符。

通过药性统计结果统计,寒性药物有清热解毒、凉血泻火利尿等作用,现代研究发现此类药物具有抗炎、止痛、抗菌等药理作用[11];五味中甘味药出现次数最多,药用频次455次,频率49.73%,其次为苦、辛、淡。“甘”为中药五味之一,具有补益、缓急、调和之效,现代药理表明,具有调整机能,补充机体不足,增强免疫力、抗菌等作用[12]。由此可见,寒性、甘味药物治疗白塞病主要为抗炎、抗菌等发挥治疗作用。

通过药物归经分析得到肝经、肾经、脾经最为常见,肝经占比28.34%最多。中医理论有肝开窍于目,肝经循行“环绕口唇、外阴”,与白塞病临床典型发病于眼睛、口腔、外阴部位相符合;肝主藏血及疏泄,湿热邪毒外感胶着于肝,疏泄不畅,气机瘀阻脉道,久为肝郁化火,“热盛则内腐,肉腐则为脓”发为“疮疡”,可见白塞病与肝经循行及生理特性相关。归经即指药物所归属的作用部位,是药物作用效果定位的理论概念,对于疾病的诊治有者指向作用[13]。现代药理研究证实归肝经药物的主要体现在抗溃疡、抑制血小板聚集、抗炎等方面[14],相关研究证实其经醋制后,提升免疫力、抗炎镇痛等效果明显提升[15]。归肾经药物组合具有抗炎、镇痛、免疫促进等药理作用[16],可能与BD的治疗相关。而相关研究证实归脾经药物主要体现为补中益气、温中化湿、理气等功效[17],其中常用的白术、干姜、黄连等药理研究表明其都具有不同程度的免疫调节功能[18]。

根据关联规则分析得到黄连-甘草为支持度、置信度最高,可能为中医药治疗白塞病常用药对。黄连-甘草作为常见的配伍药物,临床常用于多种疾病的治疗,及存在于多首方剂。甘草的现代研究起源于抗溃疡作用,还有抗病毒、调节内分泌及免疫等多种功效,对BD的疗效确切[19]。黄连主要以小檗碱(黄连素)、阿魏酸、黄连碱等化学成分,具有抗溃疡、抗炎、解热、抗肿瘤等功效[20-21],对BD的治疗可起到清热、燥湿、解毒等作用。黄连-甘草药对广泛出现于龙胆泻肝汤、甘草泻心汤的临床中证实对BD的治疗行之有效的方剂中,也证实了药对白塞病的治疗具有前期基础,为网络药理学的研究奠定了临床基础。

通过网络药理学方法对黄连-甘草对白塞病的作用机制进行探讨,得到核心靶点IL-6、VEGFA、CCL2、CXCL8、ICAM1、IL-10、IL-1β、MMP9、PTGS2、STAT3、VCAM1等排名较前,IL-6、IL-10、IL-1β、PTGS2等主要涉及机体炎症反应,STAT3、CCL2等与机体免疫应答相关,VEGFA、VCAM1、CASP3等与血管内皮保护作用相关;研究表明,BD患者IL-6、IL-10、IL-2高于健康组,且IL-6、IL-10水平与血沉呈正相关[22]。有研究发现BD患者体内血管内皮生长因子的水平明显高于正常人,可能与VEGF与VEGFR受体结合加速血管内皮细胞分裂增殖相关,也意味着BD中血管生成病变与内皮损伤相关[23]。CXCL8与其受体结合后,促使平滑肌细胞的增殖及迁移,增加MMP9因子的表达量,促进平滑肌细胞的迁移[24]。

KEGG通路富集得到黄连-甘草主要影响血管内皮的凋零、炎症反应等发挥BD的治疗作用。AGEs与RAGE结合形成氧化应激,进而使核转录因子NF-kβ激活,促使炎症因子如NO、TNF-α、1L-1β等分泌增加,导致连续的细胞损伤和功能紊乱[25]。TNF过度表达在BD的发病机制主要体现在活化中性粒细胞及T淋巴细胞,引起血管内皮损伤[26]。

本文采用数据挖掘及网络药理学的研究方法,总结临床医家的用药选方经验,从而选取核心药对;进而研究核心药对治疗白塞病的可能作用机制。同时应指出,单纯依靠文献数据挖掘医案记录、药物名称未统一等需进一步完善。初步探讨黄连-甘草治疗白塞病的作用机制,而中医遣方用药则需据患者临床症状为基础,需灵活加减;网络药理学研究方法存在一定局限,还应进一步实验验证及临床研究,从而为临床白塞病的防治提供参考。