金果胃康胶囊调控胃癌前病变大鼠HSP27及MAD2表达研究*

惠建萍 张耀之 刘海涛 王军 李龙梅* 沈舒文

(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046;2.济源市第二人民医院,河南 济源 454650;3.陕西中医药大学附属医院,陕西 咸阳 712000)

胃癌(gastric carcinoma,GC)是全球最常见的四种恶性肿瘤之一,每年全世界约有99万人被诊断为GC,其中约73.8万人死亡,晚期胃癌的中位存活率不到12个月,至今仍成为威胁人类健康的一大问题[1]。在我国,胃癌患者5年生存率为49.48%,其高发病率、低生存率、预后较差,严重威胁人类身心健康、生命安全[2]。胃癌的发生,常经历多年的胃癌前病变(gastric precancerous lesions,PLGC),胃癌前病变是胃癌的“黄金转折点”,早期防治胃癌,关键是如何正确应对胃癌前病变以及胃癌前状态[3]。胃癌前病变(PLGC)是指胃部易发生癌变的病理组织学改变,包括肠上皮化生(Intestinal Metaplasia,IM)和异型增生(Dysplasia,Dys)或上皮内瘤变(intraepithelial neoplasia,IN)。关于胃癌的形成,已被广泛接受的是Correa模式:正常胃黏膜-慢性浅表性胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-胃癌。轻、中度Dys及肠化可进展为重度异型增生或重度肠化甚至癌变,也可逆转,一项研究显示上皮内瘤变消退占60.7%、病变稳定占33.7%、病变进展占5.6%,具有有一定的癌变潜能[4-6]。到目前为止,胃癌的确切病因及发病机制还不完全清楚,因此实施一级预防几无可能。因此慢性萎缩性胃炎肠上皮化生和异型增生是阻击胃癌发生的重要战场,所以如何阻断PLGC是胃癌二级预防的重要手段之一。及早识别和控制胃癌前病变向胃癌发展是防治胃癌的重要途径。在我国中医药治疗PLGC可在很大程度上逆转IM和Dys,在防治PLGC方面已初步彰显其显著的优越性和广阔的发展前景。本实验旨在对PLGC大鼠组织MAD2与HSP27的表达进行研究,揭示金果胃康胶囊治疗PLGC的作用机理。

A.空白组;B.模型组;C.金果胃康高剂量组;D.金果胃康中剂量组;E.金果胃康低剂量组;F.维酶素组

A.空白组;B.模型组;C.金果胃康高剂量组;D.金果胃康中剂量组;E.金果胃康低剂量组;F.维酶素组

1 仪器与材料

1.1仪器 TB-718EL生物组织自动脱水机(湖北泰维公司);R136轮转式石蜡切片机(德国Leica公司);电热式恒温培养箱(日本ASONE);DMshare图像采集显微镜(德国Leica公司)。

1.2试药 金果胃康胶囊由陕西中医药大学附属医院制剂中心制成,含半枝莲、枸橘、朱砂七、太子参等药,每粒相当于原生药2.5 g。维酶素片由新乡恒久远药业有限公司提供,批号:20160412。甲基硝基亚硝基胍(MNNG)由东京化成工业株式会社生产,批号:NH8JH-QD。兔抗大鼠多克隆HSP27抗体(批号:bs-0730R),兔抗大鼠多克隆MAD2抗体(批号:bs-5731R),北京博奥森生物技术有限公司;兔IgG—免疫组化试剂盒(SABC即用型)(批号:SA1022),DAB显色试剂盒(批号:AR1022),柠檬酸盐冲液,PBS磷酸盐缓冲液,湖北省武汉市博士德生物技术公司;苏木素染液(批号:G1140),伊红染液(批号:G1100),北京索莱宝科技有限公司;

1.3实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠85只,体重180～220 g,室温为22 ℃～25 ℃,相对温度45%～60%。动物合格证编号:SCXK(陕)2021-003,由西安交通大学医学部实验动物中心提供。

2 方法

2.1实验动物分组及PLGC模型复制 参照文献[7-10],形成具体造模方案:大鼠购回适应性饲养1周后,85只大鼠按随机数字表法随机取分2组:空白对照组10只和造模组75只。除空白对照组每天自由饮水外,造模组予以:①170 μg·mL MNNG自由饮用,同时下午灌胃170 μg·mL MNNG溶液,每只灌液10 mL·kg-1。②造模期间采取饥饿无常(每进食2 d,再禁食1 d,进食日自由食用,禁食日停MNNG,自由饮用0.1%氨水,并在禁食当天下午50%乙醇按每只10 mL·kg-1灌胃。灌胃前后禁食禁水1 h。每周用钳子夹住大鼠尾部1次,使之保持激怒、争夺状态,持续10 min,持续12 w;上述各组均以混合饲料喂养12 w。并于造模结束前随机抽取造模组大鼠5只进行胃黏膜病理形态学检查,其中4只在光镜下出现肠上皮化生和异型增生为造模成功。

造模结束后,将造模组剩余70只再次按随机数字表法随机分为5组,每组14只大鼠,分别为模型对照组、金果胃康胶囊大、中、小剂量组,维酶素组。加上空白对照组10只大鼠。

2.2动物给药方法 除空白对照组10只大鼠每天自由饮水外,模型组给予2 mL生理盐水,其余4组根据《人和动物间按体表面积折算的等效计量比值表》得出大鼠给药的等效剂量(等效剂量=成人1 d剂量×0.018×5),给予相应的药物灌胃治疗。维酶素组给予维酶素混悬液2 mL灌胃(含维酶素0.034 g),金果胃康大中小剂量组每日灌胃2 mL(各含生药3.334 g、1.667 g、0.834 g),每天上午灌胃1次,连续12 w。

2.3标本收集及处理 处死大鼠前将禁食禁水24 h后,腹部注射10%水合氯醛(约3 mL·kg-1),剖腹取胃,沿胃大弯剪开,蒸馏水清洗后,然后剪取胃体部一块组织,将其置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后,组织常规脱水,石蜡包埋,切片,HE染色光镜下观察胃黏膜病理变化及免疫组化染色。

2.4HSP27、MAD2免疫组化染色步骤 免疫组织化学采用常规SABC法,操作步骤按试剂盒说明书进行。用已知阳性切片(由试剂公司提供)做阳性对照,用PBS液代替一抗作阴性对照。

2.5结果判定

2.5.1病理诊断评定标准及病理分级标准 参照2006年上海全国第二届慢性胃炎共识会议通过的《中国慢性胃炎共识意见》进行诊断及分类。

2.5.2免疫组织化学 光学显微镜下以细胞质或细胞膜出现棕黄色或棕黑色颗粒为阳性细胞。每张切片任意选择5个100倍视野,采用Image-Pro Plus图像分析软件进行分析处理,测量每个视野光度值,计算平均光密度。

2.6统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件包建立数据库,计量资料将采用均数±标准差表示,各组间的差异比较采用单因素方差分析,取双侧P<0.05为显著性检验水准。

3 结果

3.1一般情况观察 SD大鼠共85只,分空白组10只和造模组75只,造模结束后抽取造模组5只老鼠验证造模是否成功,剩余80只大鼠;药物干预期间模型组、维酶素组各死亡2只,金果胃康高、低剂量组各死亡1只,故最后剩余74只大鼠进行实验结果分析。

实验过程中,空白组大鼠被毛纯净浓密,光泽度好,双目灵活,反应敏捷喜动,进食正常,体重逐渐增加,大便有形呈颗粒状。其余各组大鼠均有不同程度病态表现:毛色逐渐变黄变暗,无光泽,精神萎靡,双眼无神,反应迟缓,扎堆不喜活动,食量逐渐减少,大便不成形,形体逐渐消瘦,背上弓,个别大鼠因营养缺乏,机能衰竭而死亡。经治疗后,大鼠的一般状态有所好转。各治疗组比正常对照组略差,但明显优于模型组。各治疗组较维酶素组状态好,以金果胃康中剂量组大鼠状态恢复最好。

3.2各组病理组织学观察 光镜下观察空白组胃黏膜结构正常,层次清楚、完整,腺体排列紧密、规则,未见炎细胞浸润;模型组胃黏膜呈不同程度的萎缩,黏膜层变薄、充血、水肿,嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润,腺体排列紊乱,部分腺体囊性扩张,上皮细胞增生,并可见黏膜部分区域出现上皮化生及异型增生,细胞核大、深染;其他用药组胃黏膜层变薄,未见充血及水肿,萎缩、肠上皮化生、异型增生程度均有明显减轻和缓解,其中金果胃康中剂量组效果最好,其次依次是金果胃康大剂量组、维酶素组、金果胃康小剂量组(图1)。

3.3免疫组化结果 染色结果:各组免疫组化染色结果阳性表达为细胞质或细胞核呈棕黄色或褐色。

3.3.1HSP27实验结果 空白组大鼠胃黏膜可见染色最轻,细胞染色数目最少,金果胃康中剂量组与其余各组相比大鼠胃黏膜可见染色较轻,染色数目较少,模型组染色最重,模型组细胞染色数目最多(见图2)。

与空白组比较,模型组大鼠胃黏膜HSP27表达水平显著上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,金果胃康胶囊高、中、低剂量组与维酶素组大鼠HSP27表达水平均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与金果胃康胶囊中剂量组比较,金果胃康胶囊高、低剂量组与维酶素组大鼠HSP27表达水平较高,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组与维酶素组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠胃黏膜HSP27检测结果

3.3.2MAD2实验结果 空白组大鼠胃黏膜可见染色最轻,细胞染色数目最少,金果胃康中剂量组与其余各组相比大鼠胃黏膜可见染色较轻,染色数目较少,模型组染色最重,模型组细胞染色数目最多(见图3)。

与空白组比较,模型组大鼠胃黏膜MAD2表达水平显著上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,金果胃康胶囊高、中、低剂量组与维酶素组大鼠MAD2表达水平均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与金果胃康胶囊中剂量组比较,金果胃康胶囊高、低剂量组与维酶素组大鼠MAD2表达水平较高,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组与维酶素组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠胃黏膜MAD2检测结果

4 讨论

中医学将PLGC归为“胃痞”“胃脘痛”等病证范畴。一般以CAG常出现的胃脘胀满、疼痛、烧心、嘈杂、口苦、纳差等症状为主要表现,又因人、因病理阶段而异而临床表现不同。沈舒文[11]认为PLGC病变过程中具有因邪致虚,因虚致邪的转化特点,其邪实是导致其虚,乃至损伤胃黏膜致肠上皮化生的直接病理因素,邪实的病理特征是湿热久藴为毒,因毒致瘀,毒瘀交阻。毒瘀交阻是发生PLGC的病机关键,故治疗本病,不论病程中正邪如何变化,始终抓住毒与瘀这个根本性病理治疗,扶正兼治毒瘀,祛邪更需围绕毒瘀,予以解毒化瘀。

金果胃康胶囊是国家级名中医建设项目沈舒文教授以解毒化瘀,行气散结为治疗原则的胃癌前病变经验方。本方由半枝莲、朱砂七、枸橘、太子参四味药组成。君药半枝莲具清热解毒,活血化瘀作用,针对主要病机,清解滋胃毒邪,消散胃络凝瘀。半枝莲抗肿瘤已经成为现代研究的主要方向[12],半枝莲抗肿瘤的主要成分为黄酮类以及多糖类,黄酮类主要作用可以改善肿瘤生长的微环境,抑制肿瘤转移扩散。张锋等[13]通过研究证实TF-SB可抑制胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,并提高其放疗敏感性。半枝莲多糖具有多种药理活性,可作为一种免疫调节剂激活免疫系统,具有增强机体免疫力、延缓衰老和抑制肿瘤等功效[14]。抗肿瘤作用主要通过抑制肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤细胞血管的生成与转移,调节免疫以及诱导肿瘤细胞的凋亡等多种途径共同实现[15]。

臣药朱砂七,为治疗胃癌的太白七药之一,其功效之一清热解毒,增强君药的解毒作用;其二活血凉血,散瘀止痛,助君药消散胃络凝瘀,且增强本方的止胃痛作用。现代药理研究朱砂七可影响肿瘤细胞的糖代谢,诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤的作用,防止肿瘤发展[16]。佐药枸橘是具有抗癌作用的理气草药,具有行气散结功效,《全国中草药汇编》记载本品具有“健胃消食,行气止痛”作用,现代药理研究枸橘具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、促进肿瘤细胞凋亡,研究表明,枸橘主要成分枸橘苷激活外源性凋亡通路抑制肿瘤细胞增长,促进肿瘤细胞凋亡[17-18]。又因PLGC的发生,多以气阴两虚为发病基础,即毒瘀交阻多发生在气阴两虚的基础上,故佐以太子参益气养阴,补益脾胃,现代药理研究表明太子参主要成分太子参环肽具有抗疲劳、增强免疫、抗菌、抗氧化、抗病毒等作用,可抑制肿瘤发生、发展[19]。四味药物合用,共奏解毒化瘀,行气散结之功,针对毒瘀交阻,胃气郁结,毒瘀并治,行气散结,可消除因毒瘀交阻滞胃碍气的症状,恢复胃主和降的功能。在前期临床试验中发现在金果胃康胶囊基础上确立组方用药的治疗组有效率82.42%,对照组有效率68.97%,治疗组疗效优于对照组,其差异有统计学意义(P<0.05)[11]。

近年来,越来越多的研究发现热休克蛋白在胃癌中过度表达,参与肿瘤的发生、发展、分化及预后等方面。热休克蛋白(heat shock protein,HSP),又称应激蛋白,是指生物细胞在生理应激或病理状态以及各种环境因素的刺激下使基因被激活,细胞内诱导合成的,且高效表达的一组进化上高度保守的胞质蛋白质。通过促进新合成蛋白质的准确折叠和变性蛋白质的重折叠来参与蛋白质质量控制[20]。HSP27(heat shock protein 27,HSP27)是小分子HSP亚家族中重要的一员,参与了细胞的增殖、分化以及细胞凋亡的信号转导调节,与肿瘤关系密切,目前研究证实,HSP27与胃癌的发生关系密切,在胃癌的表达、形成、增殖、复发、转移及肿瘤免疫中具有非常重要的作用。研究显示HSP27在胃癌中的表达率为85%,而在慢性非萎缩性胃炎和慢性萎缩性胃炎中的表达率分别为5%和35%[21]。HSP27的高水平也与胃癌和结直肠癌的进展期、不良生存率和预后有关。研究表明高水平的血清HSP27可能是评估胃癌的有用标记物[22]。

现代细胞遗传学和分子生物学研究表明,染色体不稳定性(Chromosomal Instability,CIN)是所有癌前细胞和癌细胞的本质特征,是肿瘤发生发展和异质性的发动机。CIN是指癌细胞较之于正常细胞出现的染色体数目及结构异常。绝大多数肿瘤表现为CIN,细胞周期检查点紊乱、染色体分离、DNA损伤反应及端粒功能的缺陷或丧失等多种细胞功能障碍都可导致发生CIN[23]。染色体正确分离过程中有一个由检查点蛋白(Checkpoint Protein,CP)组成的监控体系,能准确地识别纺锤体微管与染色体动粒的连接,从而保证染色体的正常分离。有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(Mitotic Arrest Deficient 2,MAD2)是的关键成分之一,可以通过磷酸化和去磷酸化来调节其蛋白的活性起到调节纺锤体微管与染色体动粒的连接的作用。MAD2功能改变,可引起纺锤体检查点控制失常,导致染色体不稳定性增加,染色体缺失的概率升高[24]。其机制可能是:MAD2的异常使纺锤体组装检查点的功能出现缺损,不能阻滞动粒-微管结合异常的肿瘤细胞进行有丝分裂,而导致染色体多极化,引起非整倍体细胞的形成,导致肿瘤的发生,这些异常改变进而又有可能成为肿瘤诊断标记和治疗靶点。王玉[25]发现MAD2L1在胃癌发病机制中扮演着高表达的癌基因的角色。

由此可见,HSP27、MAD2在胃癌前病变中呈高表达,而在正常组织细胞中不表达或很少表达。本研究结果表明,在PLGC中,HSP27、MAD2表达较高,经金果胃康胶囊治疗后,两种蛋白的阳性表达率显著降低,其中金果胃康胶囊中剂量效果最显著。两种蛋白表达降低,表示金果胃康胶囊可能抑制HSP27的表达和通过控制MAD2稳定染色体的不稳定性,从而促进PLGC细胞的凋亡,使细胞逐渐恢复正常,逆转胃黏膜损伤的各项病理生化指标,保护、修复胃黏膜损伤,阻断PLGC向胃癌的转变。