荔枝核总黄酮对猪血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠肝脏中EGR1、TGF-β1表达的影响*

唐尧 欧士钰 杜凌 韦捷 陈刚 何映雪

(柳州市工人医院消化内科,广西 柳州 545007)

慢性肝病在世界范围内的发病率很高,在其发展阶段,目前还没有有效的治疗方法,是一个主要的全球健康问题。此外,不同的慢性肝病的病因对肝脏的损伤均可触发肝纤维化发生形成。当肝损伤发生时,纤维化的进展将使慢性肝病进入终末期,导致肝硬化、肝癌发生[1]。肝纤维化是这个进程的中间和必经阶段,是肝脏细胞外基质(ECM)合成增多、降解减少,ECM过度沉积的病理生理过程[2]。目前认为,肝纤维化乃至早期肝硬化是减少可以逆转的[3]。

早期生长反应因子1(early growth response factor 1,EGR1)是一种含锌指的转录因子,在受到生长因子和脂多糖等多种刺激后立即表达。有报道认为Egr-1可以调控涉及创伤愈合过程和免疫应答的基因[4]。纤维化是组织受到损伤后修复的过程,研究证实EGR1可以调控转化生长因子β1(TGF-β1)等细胞因子参与调控器官纤维化,在肾纤维化过程中发挥促纤维化作用[5-7],但其在肝纤维化中的作用报道少见。

荔枝(Litchi)是无患子科植物,盛产于中国南方,荔枝核性味甘、微苦,温,归肝、肾经,具行气散结、祛寒止痛之功效,民间用于主治寒疝腹痛、睾丸肿痛[8],近年研究表明荔枝核还具有抗炎、抗肿瘤、保肝等药理作用[9-10]。本研究中的荔枝核总黄酮(total flavonoids from Litchi seed,TFL)是从荔枝核提取的有效药理成分,课题组前期实验研究表明TFL在二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型中具有肝保护、抗肝纤维化作用[11-12]。但其机制尚未完全明确。本研究将通过猪血清诱导大鼠免疫性肝纤维化模型,通过观察TFL对肝纤维化大鼠肝组织EGR1的影响,探讨肝纤维化的机制及抗肝纤维化的潜在靶点。

1 仪器与材料

1.1仪器 H1850R高速冷冻离心机(湖南湘仪);Infinite F50酶标仪(TECAN公司);Mini-PROTEAN Tetra电泳仪、Mini Trans-Blot转膜仪(Bio-Rad公司);BX51光学显微镜(日本奥林巴斯公司);tannon 4600化学发光凝胶成像系统(Tanon公司)。

1.2试药 TFL购自南京泽朗公司,纯度80%;无菌猪血清,新鲜猪血清离心除菌自制;秋水仙碱购自西双版纳版纳药业;大鼠血清中透明质酸(hyaluronic acid,HA)、ELISA、Ⅲ型前胶原(type Ⅲ procollagen,PCⅢ)、层粘连蛋白(laminin,LN)、Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen,CⅣ) ELISA 试剂剂盒均购自厦门康研公司;抗TGF-β1抗体购自proteintech公司;GAPDH单克隆抗体及过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥;增强化学发光试剂(ECL)购自美国Pierce公司。

1.3实验动物 60只SPF级健康SD大鼠,雄性,重量(200±20)g,由广西医科大学实验动物中心提供,实验动物许可证号:SYXK(桂)2014-0003。

2 方法

2.1模型建立及分组 所有大鼠实验前适应性饲养1 w,60只大鼠随机分成6组,每组10只,分别为正常对照组、模型组、TFL低、中、高剂量组及秋水仙碱阳性对照组。除正常对照组外,其余各组大鼠腹腔注射猪血清[13],每只每次注射0.5 mL,2次·w-1,连续注射12 w。自造模开始,TFL低、中、高剂量组分别灌胃给予100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、300 mg·kg-1TFL混悬液灌胃,秋水仙碱阳性组灌胃给予秋水仙碱溶液0.1 mg·kg-1,正常对照组与模型组灌胃给予等量蒸馏水。

2.2动物处理 12 w末次给药后,禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血5 mL离心并取血清,4℃冷藏备用。取肝脏左叶组织福尔马林溶液中固定,取右叶组织拟提取组织总蛋白。

2.3肝脏组织形态变化观察 肝左叶福尔马林溶液中固定,石蜡包埋,切片,厚4 mm,常规HE染色,光镜下观察各组大鼠肝脏组织结构的变化,采用Ishak半定量法进行统计评价[14]。

2.4ELISA法检测血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ的含量 严格按照试剂盒说明书测定大鼠血清中HA、PCⅢ、LN及CⅣ水平。

2.5EGR1、TGF-β1蛋白表达的定量分析 提取肝组织总蛋白、BCA法测定蛋白含量、蛋白变性,配好浓缩胶、分离胶,加入电泳液,按20μg/孔蛋白上样,恒压电泳,然后恒流转膜到PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭1 h,用相应稀释的一抗Egr1(1∶500),TGF-β1(1∶150)在4℃孵育过夜。室温TBST洗3次,每次水平摇床上振荡每次10 min,加入相应二抗摇床孵育1 h,TBST洗膜3次,每次水平摇床上振荡每次10 min。用ECL的试剂盒在暗室中曝光、显影。Image J软件分析目的蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1各组大鼠肝脏组织病理学变化 HE染色结果见,正常对照组肝组织肝小叶结构清晰,肝细胞索由中央静脉向四周放射状排列,有少量胶原合成于肝门束(Ishak肝纤维化评分0.60±0.70)。与正常对照组比较,模型组纤维化评分(4.90±0.57)明显加重,具有统计学差异(P<0.05),见正常肝小叶结构紊乱或被破坏或消失,少量肝细胞坏死,汇管区可见大量网状纤维、胶原纤维,纤维间隔增厚,肝细胞索排列紊乱,局部可见假小叶形成,提示肝纤维化模型造模成功。与模型组比较,TFL各剂量组纤维化评分(高剂量组3.0±0.47、中剂量组3.4±0.84、低剂量组3.70±0.82)及秋水仙碱阳性组肝纤维化评分(2.9±0.74)明显降低,具有统计学差异(P<0.05),且各组改善大鼠肝纤维化程度呈剂量依赖性,见图1和表1。

表1 TFL对大鼠肝纤维化程度的影响

A.正常对照组;B.模型组;C.TFL低剂量组;D.TFL中剂量组;E.TFL高剂量组;F.阳性对照组

3.2TFL对各组大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ含量的影响 与正常对照组比较,模型组大鼠血清中HA、PCⅢ、LN及CⅣ的含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,秋水仙碱阳性组以及TFL各剂量组HA、PCⅢ、LN及CⅣ的含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 TFL对肝纤维化大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ含量的影响

3.3TFL对大鼠肝组织中EGR1、TGF-β1蛋白表达的影响 实验结果显示,与正常对照组比较,模型组大鼠肝组织中EGR1、TGF-β1蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阳性组、TGF-β1以及TFL各剂量组大鼠肝组织匀浆中EGR1、TGF-β1蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图2,表3。

表3 TFL对肝纤维化大鼠肝组织EGR1、TGF-β1 蛋白表达的影响

4 讨论

肝纤维化是由于一种或多种因素共同作用引起的肝脏炎症和损伤[1-2]。本研究中我们通过每周两次共12周腹腔注射猪血清模拟人体内免疫复合物所致的Ⅲ型过敏反应,诱导构建免疫性肝纤维化动物模型[13]。造模同时我们给予TFL干预,观察TFL抗肝纤维化的作用。HA、PCⅢ、LN、CⅣ常用于临床上评估慢性肝病患者病情[15-16]。本实验中,模型组结合大鼠血清中肝纤四项含量显著升高、病理学提示肝纤维化模型构建成功,而TFL各剂量组能够降低肝纤四项在肝纤维化模型血清中含量,病理学HE检测结果显示TFL高、中、低各剂量组肝纤维化程度较明显组明显减轻,均提示TFL能够有效改善猪血清诱导的SD大鼠的肝纤维化程度。

肝纤维化的发病的中心环节是肝星状细胞(HSCs)的激活[1-2,17]。HSCs激活后通过邻近细胞如窦状隙内皮细胞、库普弗细胞(Kupffer cell,KC)、肝细胞等的旁分泌作用,内皮细胞、KC细胞能够通过分泌TGF-β1等细胞因子,这些细胞因子正反馈促使HSC持续激活并转化为肌成纤维细胞,使其迁移、增殖并产生Ⅰ、Ⅲ型胶原等ECM,参与促使肝纤维化不断进展[2]。TGF-β1是比较明确的能促进肝纤维化的细胞因子,它可激活HSCs,导致ECM的合成增多、降解减少[2,18]。同时以往的体外实验也显示HSC-T6细胞株在TGF-β1的刺激下,激活NF-kB,进而促进HSC的激活[19]。

早期生长反应因子1(EGR1)是一种转录因子,广泛参与细胞的生长、分化、增殖、凋亡等生命活动,参与调控器官纤维化[20-22]。研究表明,EGR1可调控TGF-β1基因的转录[21],TGF-β1也可以诱导EGR1的表达[24],EGR1、TGF-β1之间具有相互调控作用。甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)可通过诱导启动子区低甲基化激活EGR1的表达,在一定程度上通过上调EGR1的表达促进了肾纤维化的发生[25],抑制EGR1可显著减弱TGF-β1诱导的Smad2/3和ERK1/2的激活[25]。近年来有研究表明,EGR1与肝纤维化密切相关,它可以促进肝纤维化的进展[26-27]。本实验中,与正常对照组比较,模型组大鼠肝组织EGR1、TGF-β1蛋白表达明显升高,提示EGR1参与了猪血清诱导的大鼠肝纤维化,而TFL高、中、低各剂量组能够显著降低模型大鼠肝脏中EGR1、TGF-β1蛋白的表达水平,提示TFL可抑制猪血清诱导的肝组织EGR1、TGF-β1蛋白的增高,表明EGR1、TGF-β1参与促进了肝纤维化的进展。综上,TFL可能通过降低肝脏内TGF-β1、EGR1蛋白的表达,抑制HSCs的增殖和减少ECM的合成改善肝纤维化。

本研究表明,EGR1可能参与了猪血清诱导的肝纤维化进程,TFL可改善猪血清诱导的肝纤维化,其机制可能与TFL抑制EGR1、TGF-β1蛋白的表达有关。本研究的局限性在于血清诱导的肝纤维化进程中TGF-β1、EGR1之间相互调控的直接作用机制尚未明确,进一步的TGF-β1、EGR1的上游、下游调控的分子机制,尚需要我们进一步深入研究。