五味子醇提物喷雾干燥工艺优化及体外抗氧化活性评价

张靖鹏，解 芳，麻淑珍

（1.中国检验认证集团青海有限公司，青海西宁 810000；2.青海康普生物科技股份有限公司，青海西宁 810003）

五味子（Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.） 又称北五味子，是木兰科植物干燥果实，含有丰富的木脂素、多糖、挥发油、黄酮和有机酸等[1]，其中有效成分为五味子醇甲，又称五味子素，包含五味子甲素、五味子乙素及五味子丙素，使五味子中重要的有效成分成为一些药物的主要药效物质[2-3]。研究表明，五味子具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等中医功效，以及调节免疫、抗氧化、抗疲劳、降血糖、保肝、抗衰老、抗肿瘤、抑制帕金森症等作用[3-4]，五味子醇甲还具有预防及治疗神经退行性疾病、缓解肝损伤、调节改善睡眠、缓解抑郁、抗氧化应激及保护脑缺血等功效[5-13]。目前，工业生产中常采用70%～80%（V/V） 的乙醇对五味子醇甲进行提取[14]，辅以一定比例的辅料后使用喷雾干燥技术制备微胶囊[15]。刘慧等人[16]研究不同DE 值的麦芽糊精对五味子喷雾干燥的影响，发现加入麦芽糊精后得粉率增加，含水量降低，玻璃化转变温度升高，流动性变好，微观形态呈球形。此外，通过研究五味子多糖微囊制备工艺发现通过优化喷雾干燥工艺，在五味子多糖与壳聚糖质量比为1∶3，进风温度为160 ℃，进料速度为5 mL/min，空气流速为600 L/h条件下，所制备的微囊粉表面光润且载药量、收率、包封率及缓释性能达到最佳[17]。饶小勇等人[18]通过对五味子提取物喷雾干燥工艺进行研究，发现辅料添加量及进风温度均会影响五味子喷干粉的颗粒性质。乙醇作为常用的浸提剂已被广泛使用到植物提取物的生产及试验中[19]，但其不可难免会残存在产品中。研究表明，乙醇可能对人体多个器官（如肠道、胃及脑） 均有损伤作用[20]。因此，如何进一步在五味子醇提后的制粒过程中保留有效成分而去除乙醇残留成为研究的重点。

1,1 - 二苯基- 2 - 三硝基苯肼（2,2,-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2'- 联氨- 双- 3 - 乙基苯并噻唑啉- 6 - 磺酸（2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 均具有反应稳定、易操控等特点，常作为体外自由基清除能力评价指示剂使用，而总还原能力（Ferric Reducing Antioxidant Power，FRAP） 与铜离子还原能力（Cupric Reducing Antioxidant Power，CuPRAC） 则是通过还原金属离子进行评估的另一种体外抗氧化方法[21-22]。此外，通过响应面法优化五味子提取物喷雾干燥工艺，可进一步提高有效成分含量及得率[23]。研究表明，五味子具备较强的抗氧化能力[3]，通过对工艺优化后的喷雾干燥工艺后所得的五味子醇提物进行体外抗氧化试验可以进一步验证提取物的抗氧化作用。

以五味子醇甲及乙醇残留量为响应值，采用单因素分析、Box-benhnken 响应面优化五味子醇提物喷雾干燥工艺，通过体外抗氧化试验对工艺优化后的五味子醇提物的体外抗氧化能力进行验证评价，为五味子提取物的加工提供一定实践及理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及设备

五味子，购自辽宁省岫岩满族自治县；食品级酒精（纯度95%），梅河口市阜康酒精有限责任公司提供；DPPH、ABTS；2,9- 二甲基-1,10- 菲啰啉（新亚铜灵）；L- 抗坏血酸标准品（维C） （Scientific Phygene）；FRAP（T-AOC） 试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；其余试剂均为国产分析纯。

754PC 型紫外可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；ST-360 型酶标仪，上海科华生物工程股份有限公司产品；HH-4 型数显恒温水浴锅，天津赛得利斯实验分析仪器制造厂产品；LPG-5 型喷雾干燥机组，江苏先锋干燥工程有限公司产品；R5002K 型旋转蒸发仪，上海夏丰实业有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 五味子醇提工艺

将五味子粉碎，加入乙醇（60%），提取2 h 后，浓缩至可溶性固形物含量为20%，添加一定比例辅料后进行喷雾干燥，最终得到五味子醇提物。

1.2.2 单因素试验

以喷雾干燥过程中不同进口温度、出口温度、进料速度与雾化器离心频率进行单因素试验，考查不同因素对喷干粉中五味子醇甲含量及乙醇残留量的影响。除变化量外，试验固定进口温度为160 ℃，出口温度为80℃，进料速度为3 mL/s，离心频率为160 Hz，分别研究进口温度（140，150，160，170，180 ℃）、出口温度（70，75，80，85，90 ℃）、进料速度（1，2，3，4，5 mL/s）、离心频率（140，150，160，170，180 Hz） 对五味子醇甲含量及乙醇残留量的影响。

1.2.3 响应面试验设计

根据单因素确定3 个水平，以进口温度、出口温度、进料速度与离心频率为试验因素，以五味子醇甲含量及乙醇残留量为响应值，采取Box-behnken中心组合法进行四因素三水平试验设计。

响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

1.2.4 理化检测

检测喷干粉中五味子醇甲含量使用《中国药典2020 年版》第一部五味子项下中五味子醇甲含量的检测方法，检测乙醇残留量参照《中国药典2020 年第四部》通则0861 残留溶剂测定法进行测定。

1.2.5 体外抗氧化能力评价

样品设置见表2。

表2 样品设置

分别称取4 种醇提物及维C 3.5 mg/mL 样本溶液，对上述样本溶液依次进行梯度稀释，得到1.0，2.0，2.5，3.0，3.5 mg/mL 质量浓度梯度的样本及对照品溶液。

（1） DPPH 自由基抗氧化能力测定。称2 mgDPPH，用乙醇溶解定容至25 mL，得到DPPH 储备液。吸取DPPH 储备液15 mL 并用乙醇定容至25 mL，得到DPPH 工作液。于96 孔板中加入200 μL 的DPPH 工作液，再各自加入5 μL 样本溶液和5 μL 维C 溶液，分别作为样品组和阳性对照组，每隔5 min 于波长517 nm 处测定OD 值，直至测至30 min，空白对照组以乙醇代替样本溶液。DPPH 自由基清除率计算公式为：

式中：OD1——空白对照组吸光度；

OD2——样本组吸光度。

（2） ABTS 自由基抗氧化能力测定。称取ABTS 57.6 mg，用浓度为0.02 mol/L 的醋酸缓冲液溶解，定容至15 mL。称取硫酸钾6.6 mg，用浓度为0.02 mol/L的醋酸缓冲液溶解，定容至10 mL。取ABTS 溶液5 mL和过硫酸钾溶液5 mL，混匀后避光反应12 h，得到ABTS 母液。吸取ABTS 母液280 μL，用浓度为0.02 mol/L 的醋酸缓冲液稀释至6.5 mL，避光反应30 min 后，即得ABTS 工作液。

将96 孔板中加入200 μL 的ABTS 工作液，再各自加入10 μL 样本溶液和10 μL 维C 溶液，分别作为样品组和阳性对照组。每隔10 min 于波长734 nm 处测定OD 值，直至测至60 min，空白对照组以乙醇代替样本溶液。ABTS 自由基清除率计算公式为：

式中：OD1——空白对照组吸光度；

OD2——样本组吸光度。

（3） FRAP 抗氧化能力测定。以试剂盒提供的试验方法进行试验，于比色皿中加入1 800 μL FRAP工作液，再分别加入样本溶液50 μL，将其置于25～37 ℃下孵育10 min，于波长520 nm 处检测吸光度，根据吸光度计算公式：

式中：A1——测定组吸光度；

A2——空白组吸光度；

T——反应时间（30 min）；

V1——取样量，mL；

V2——反应液总体积，mL。

（4） CuPRAC 抗氧化能力测定。称取CuCl2·2H2O 4.28 mg 加水溶解，定容至25 mL，摇匀备用；称取19.27 g 醋酸铵加水溶解，定容至250 mL，摇匀备用；称取164.89 mg 新亚铜灵（2,9- 二甲基-1,10- 菲啰啉） 加无水乙醇溶解，定容至100 mL，摇匀，避光保存。

吸取新亚铜灵溶液、CuCl2溶液和醋酸铵溶液各1 mL，分别加入维C（3.5 mg/mL） 溶液10，20，30，40，50，60 μL 后用无水乙醇补足4 mL，避光反应30 min 后于波长450 nm 处检测OD 值。作标准曲线，得回归方程。按上述操作加入样品溶液2.5 μL，反应30 min 后于波长450 nm 处检测OD 值。根据样品OD 值，带入回归方程得到对应的清除维C-Cu2+还原能力值。

1.2.6 数据分析

试验数据使用SPSS 17 软件对数据进行统计分析，每个试验重复3 次。试验数据使用SPSS 17 软件进行统计分析。数据采用单因素ANOVA 分析，以评价2 组差异的显著性。使用Design Expert V8.0.5软件对响应面模型进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 进口温度对五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇残留量的影响

进口温度对喷干粉中五味子醇甲含量（a） 及乙醇残留量（b） 的影响见图1。

图1 进口温度对喷干粉中五味子醇甲含量（a）及乙醇残留量（b） 的影响

由图1（a） 可知，当进口温度为140～150 ℃时，喷干粉中五味子醇甲含量随着进口温度的升高而增加，可能是由于水分及乙醇不断散失造成五味子醇甲含量不断增加[26]。当进口温度升高至160 ℃以上时，五味子醇甲含量明显下降，可能由于温度过高导致五味子醇甲分解[24]。

由图1（b） 可知，随着进口温度上升，喷干粉中的乙醇残留量逐渐降低，可能是由于乙醇受热后不断散失而造成[24]。

2.1.2 出口温度对五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇残留量的影响

出口温度对喷干粉中五味子醇甲含量（a） 及乙醇残留量（b） 的影响见图2。

图2 出口温度对喷干粉中五味子醇甲含量（a）及乙醇残留量（b） 的影响

由图2（a） 可知，当出口温度为70～80 ℃时，喷干粉中五味子醇甲含量随着进口温度的增加而增加，可能是由于水分及乙醇不断散失造成五味子醇甲含量不断增加[16]。当出口温度增加至85 ℃以上时，五味子醇甲含量略有下降，可能由于温度过高导致五味子醇甲部分分解[14，18]。

由图2（b） 可知，随着出口温度上升，喷干粉中的乙醇残留量逐渐降低，可能是由于乙醇受热后不断散失而造成[14]。

2.1.3 进料速度对五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇残留量的影响

进料速度对喷干粉中五味子醇甲含量（a） 及乙醇残留量（b） 的影响见图3。

图3 进料速度对喷干粉中五味子醇甲含量（a）及乙醇残留量（b） 的影响

由图3（a） 可知，当进料速度在3 mL/s 以下时，喷干粉中的五味子醇甲含量不断升高，说明随料液增加五味子醇甲受温度影响较小并喷干粉中不断累积，当将进料速度增加至3 mL/s 以上时，喷干粉中五味子醇甲含量会稍有下降，是由于进料过快导致干燥效率降低，从而导致部分喷干粉出现粘壁，而塔壁温度过高而导致五味子醇甲受热分解[16，18]。

由图3（b） 可知，随着进料速度增加，喷干粉中的乙醇残留量逐渐升高，可能是由于进料速度过快而乙醇无法完全挥发[14]。

2.1.4 离心频率对五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇残留量的影响

离心频率对喷干粉中五味子醇甲含量（a） 及乙醇残留量（b） 的影响见图4。

图4 离心频率对喷干粉中五味子醇甲含量（a）及乙醇残留量（b） 的影响

由图4（a） 可知，当雾化器离心频率为160 Hz以下时，喷干粉中的五味子醇甲含量不断升高，说明随着雾化器离心频率增加喷干粉雾化效果变好，五味子醇甲在喷干粉中不断累积，当将离心频率增加至160 Hz 以上时，喷干粉中五味子醇甲含量会有所下降，可能由于离心频率过快会导致干燥效率降低，导致部分喷干粉出现粘壁，塔壁温度过高而导致五味子醇甲受热分解[16，18]。

由图4（b） 可知，随着离心频率增加，喷干粉中的乙醇残留量逐渐下降，至170 Hz 时则趋于平缓，可能是由于离心频率过高，导致喷干粉雾化颗粒中水分及乙醇蒸发不彻底，导致乙醇无法完全挥发[16，18]。

2.2 响应面优化分析

2.2.1 响应面试验结果

在单因素试验的基础上，选取进口温度、出口温度、进料速度及离心频率4 个因素为变量，以喷干粉中五味子醇甲含量及乙醇残留量为响应值，采用Design Expert 8.0.6 统计软件进行四因素三水平试验。

响应面试验设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果

采用Design Expert 8.0.6 软件对试验结果进行二次多元回归分析，对自变量A、B、C、D与五味子醇甲含量（方程A） 及乙醇残留量（方程B） 进行多元二项式方程拟合。回归方程，如下：

方程A：

方程B：

2.2.2 响应面方差分析

方差分析结果见表4。

表4 方差分析结果（b）

表4 方差分析结果（a）

回归方程显著性检验p＜0.05，表明模型具有显著性；失拟项p=0.082 7，0.198 0＞0.05，表明方程拟合程度较高，无明显失拟存在，此模型成立[23]。

出口温度和进口温度的响应面图见图5，进料速度和进口温度的响应面图见图6，离心频率和进口温度的响应面图见图7，进料速度和出口温度的响应面图见图8，离心频率和出口温度的响应面图见图9，进料速度和离心频率的响应面图见图10。

图5 出口温度和进口温度的响应面图

图7 离心频率和进口温度的响应面图

图8 进料速度和出口温度的响应面图

图9 离心频率和出口温度的响应面图

图10 进料速度和离心频率的响应面图

由图5 ～图10 可以直观地反映各因素间的交互作用及各因素与响应值间的关系。响应面坡度越陡表示两因素交互作用越大，反之则表示两因素交互作用不显著[23]。

经软件分析，五味子醇提物最佳喷雾干燥工艺为进口温度160.1 ℃，出口温度85.4 ℃，进料速度2.8 mL/s，离心频率159.6 Hz，预测五味子醇甲含量为0.902 49%。为了便于控制试验条件，将最佳工艺调整为进口温度160 ℃，出口温度85 ℃，进料速度3 mL/s，离心频率为160 Hz。应用此条件进行3 次平行试验，平均五味子醇甲含量为（0.85±0.01） %（RSD＜2%），乙醇残留量为（0.34±0.01） %（RSD＜2%），与预测值接近，说明该模型可用于拟合分析，结果稳定可靠，与其他研究的相关提取参数一致[23]。

2.3 体外抗氧化试验结果

2.3.1 DPPH 自由基清除能力测定

DPPH 抗氧化试验（浓度测试（a））、反应时长测试（b）） 见图11。

图11 DPPH 抗氧化试验（质量浓度测试（a））、反应时长测试（b））

由图11 可知，在相同活性成分浓度含量、反应时间条件下，维C 及五味子醇提物D 对DPPH 自由基清除能力最强，五味子醇提物C（工艺优化后）对DPPH 自由基也有较强的清除能力，五味子醇提物C 较具有较强的清除能力，五味子醇提物A 与B的清除能力相当，且均有剂量依赖性。其中，五味子醇提取C 的IC50（半清除率质量浓度） 达3.5 mg/mL以上。40 min 时，3.5 mg/mL 的不同五味子醇提物对DPPH 自由基清除能力的顺序为维C＞五味子醇提物D＞五味子醇提物C＞五味子醇提物A＞五味子醇提物B。

2.3.2 ABTS 自由基清除能力测定

ABTS 抗氧化试验（浓度测试（a）、反应时长测试（b）） 见图12。

图12 ABTS 抗氧化试验（质量浓度测试（a）、反应时长测试（b））

由图12 可知，在相同活性成分浓度含量、反应时间条件下，维C 及五味子醇提物C（即工艺优化后） 对DPPH 自由基清除能力最强，五味子醇提物D 较五味子醇提物B 具有较强的清除能力，五味子醇提物A 则清除能力最弱，且均有剂量依赖性。其中，五味子醇提取C 的IC50（半清除率质量浓度） 在4.0 mg/mL 以下。40 min 时，5 mg/mL 的不同五味子醇提物对DPPH 自由基清除能力的顺序为维C＞五味子醇提物C＞五味子醇提物B＞五味子醇提物D＞五味子醇提物A。

2.3.3 FRAP 抗氧化能力测定

FRAP 抗氧化试验（质量浓度测试） 见图13。

图13 FRAP 抗氧化试验（质量浓度测试）

由图13 可知，五味子醇提物C（工艺优化后）具有最强的还原能力，其次为五味子醇提物B 和D，五味子醇提物A 则相对较弱。

2.3.4 CuPRAC 抗氧化能力测定

CuPRAC 抗氧化试验（质量浓度测试） 见图14。

图14 CuPRAC 抗氧化试验（质量浓度测试）

由图14 可知，从还原能力来看，五味子醇提物C（工艺优化后） 对Cu2+离子的还原能力最强，五味子醇提物D 次之，五味子醇提物A 与B 还原能力几乎一样。

3 讨论

五味子醇甲作为五味子中重要的活性成分是评价产品品质的重要指标[2]，多项研究都表明五味子醇甲具有一定药效功能[3]，是加工药品或保健食品的重要药用植物。作为醇溶性物质，五味子醇甲一直使用乙醇提取[14]，可能造成喷雾干燥后终产品中的乙醇残留量升高，最终造成对人体的危害[20]。

基于单因素试验、响应面优化试验，进一步优化五味子醇提取物喷雾干燥工序的相关关键工艺条件，从而得到最优工艺条件。此外，通过使用体外抗氧化试验的方法对工艺优化前后所制备的喷干粉进行对比试验，试验发现工艺优化后的五味子醇提物较其他样品具有更高的体外抗氧化能力，对人体更为有利[3]。通过单因素试验发现，进、出口温度的增加均可能会降低喷干粉中五味子醇甲的含量，进料速度过快及离心频率的增加可能导致乙醇残留量过高。响应面试验表明，在最优喷雾干燥工艺条件下，可以获得五味子醇甲较高且乙醇残留量较低的喷干粉。此外，体外抗氧化试验结果显示，通过工艺优化所得的五味子醇提物较优化前具有更高抗氧化特性，而醇提浓缩液相对抗氧化性较弱，可见喷干粉可以进一步富集有效成分[18]。

4 结论

通过单因素试验及响应面法设计优化了五味子醇提物喷雾干燥工艺最佳工艺条件。结果表明，五味子醇提物的最佳工艺条件为进口温度160 ℃，出口温度85 ℃，进料速度3 mL/s，雾化器离心频率160 Hz。应用此条件进行3 次平行试验，平均五味子醇甲含量达到0.85%，乙醇残留量为0.34%。此外，通过进行体外抗氧化试验，发现五味子醇提物（工艺优化后） 对ABTS 自由基、DPPH 自由基均有最较强清除能力，且对Cu2+的总抗氧化能力最强，进一步说明工艺优化后不但可以有效提高五味子醇甲的含量及将乙醇残留量降到最低，最大程度地保留五味子中的抗氧化成分。由此，经过对五味子醇提物喷雾干燥工艺及抗氧化能力进行研究，可以为五味子提取物的进一步研制开发提供了一定的实践及科学依据。