Plackett-burman 法优化荞麦多糖提取工艺及体外抗氧化活性研究

张志威，周文喜，孟晶晶，秦雪姿，倪 娜，王 华

（1.内蒙古民族大学，内蒙古通辽 028043；2.通辽市农牧科学研究所，内蒙古通辽 028000）

荞麦是一年生草本植物，又名乌麦、三角麦等，目前有2 个栽培品种，分别是甜荞（F.esculentum）和苦荞（F.tataricum），分布范围广泛，栽培历史悠久[1-2]。内蒙古是荞麦的主产区之一，通辽地区的荞麦种植面积居全区首位，种植面积为20.48 khm2，总产量0.20 亿kg，主要集中在库伦旗，产量约占全国总产量的1/3。另外，荞麦在奈曼旗和科尔沁左翼后旗等地也有不小的种植面积和产量[3]。

据已知数据，荞麦中谷蛋白含量低，主要蛋白质是球蛋白，必需氨基酸中赖氨酸含量较高，蛋氨酸含量低，膳食纤维含量也极为丰富，与普通稻米相比，可以高出10 倍以上，并且荞麦比普通谷物含有更多种类和含量的微量元素[4]。荞麦不仅营养丰富，还富含多糖、黄酮、糖醇等生物活性物质，并具有抗氧化、降脂、抑菌、抗炎等生物功能活性[5-10]。

目前，对于荞麦的研究绝大多数都集中在黄酮类物质和蛋白质，对多糖的研究鲜有报道。因此，试验选用通辽当地广泛种植的品种——通荞3 号为研究对象，采用Plackett-burman 试验和Box-behnken试验优化荞麦多糖提取工艺，对其体外抗氧化能力进行了相关研究。以期为通辽地区荞麦资源的进一步开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荞麦（通荞3 号），通辽市农牧科学研究所提供。将种子研磨过筛，置于4 ℃冰箱中备用。

石油醚（60～90 ℃）、无水乙醇，均为分析纯，天津大茂试剂有限公司提供；中性蛋白酶（50 000.0 U/g），北京索莱宝科技有限公司提供；果胶酶（≥50.0 U/g）、纤维素酶（≥15 000.0 U/g），国药集团化学试剂有限公司提供；DPPH 自由基清除能力试剂盒、总抗氧化能力试剂盒（FRAP 法）、总抗氧化能力试剂盒（ABTS 法），南京建成生物工程研究所提供。

1.2 仪器与设备

XM-P30H 型无级调功超声波清洗机，小美超声仪器（昆山） 有限公司产品；RE-2000B 型旋转蒸发器，上海亚荣生化设备仪器有限公司产品；5804R型高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司产品；Infinite M200 型多功能酶标仪，瑞士帝肯公司产品；SA224S 型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司产品；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 荞麦多糖提取流程

干燥荞麦粉→石油醚回流脱脂→干燥→80%乙醇回流脱色→干燥→加酶和适量蒸馏水置于超声波清洗机→离心→上清液减压浓缩→离心→取沉淀，加适量蒸馏水溶解→糖液减压浓缩→-20 ℃预冷，-80 ℃冷冻→真空冷冻干燥→荞麦粗多糖。

1.3.2 荞麦多糖的含量测定及计算

荞麦多糖测定采用苯酚- 硫酸法，依据相关行业标准进行试验操作[11]，绘制标准曲线。得线性回归方程Y=0.870 8X-0.007 2，R2=0.999 3。

1.3.3 荞麦多糖得率计算

取一定量样品液按照上述试验步骤操作。重复3 次取平均值。根据标准曲线测定吸光度，按照下列公式计算荞麦多糖得率。

1.4 单因素试验设计

准确称取苦荞粉5.0 g，放入200 mL 锥形瓶中，在其他条件相同的情况下，依次采用不同中性蛋白酶添加量、纤维素酶添加量、果胶酶添加量、料液比、pH 值、提取温度、超声波功率进行提取工艺优化，分析不同试验条件对多糖得率的影响。

1.5 Plackett-burman 试验设计

在单因素试验的基础上，以荞麦多糖得率为响应值，使用Design Expert.V 8.0.6.1 进行Plackettburman 试验的设计试验设计。

Plackett-burman 试验因素与水平设计表1。

表1 Plackett-burman 试验因素与水平设计

1.6 最陡爬坡试验设计

据上述试验选出显著因素，观察其正、负效应，设计合理的步长，增加试验的密集度，从而获得最佳提取工艺区域的方法，将此最佳结果作为响应面试验的中心点展开试验[12]。

1.7 响应面试验设计

根据上述试验结果，采用Design Expert.V 8.0.6.1进行Box-behnken 试验设计，荞麦多糖得率作为响应值，设计各因素及其对应水平。

Box-behnken 试验因素与水平设计见表2。

表2 Box-behnken 试验因素与水平设计

1.8 荞麦多糖体外抗氧化试验设计

1.8.1 荞麦多糖对DPPH 自由基清除能力的测定

根据教小磐等人[13]的试验方法稍加改动。待测样品于波长517 nm 处测定吸光度，并根据以下公式计算DPPH 自由基清除率。

式中：Ax——不同多糖溶液吸光度；

A0——对照溶液吸光度。

1.8.2 荞麦多糖对ABTS+自由基清除能力的测定

参考沈成龙等人[14]的方法适当调整，待测样混匀后置于室温反应6 min，于波长405 nm 处测定吸光度，根据以下公式计算ABTS+自由基清除率。

式中：Ax——不同多糖溶液吸光度；

A0——对照溶液吸光度。

1.8.3 荞麦多糖还原能力测定

Fe2+还原能力测定依据孙朋真等人[15]的方法稍作修改。配制不同质量浓度的荞麦多糖溶液于试管中，分别加入提前配制的FRAP 工作液，混匀后于37 ℃条件下孵育3～5 min，于波长593 nm 处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 中性蛋白酶添加量的确定

中性蛋白酶添加量对荞麦多糖得率的影响见图1。

图1 中性蛋白酶添加量对荞麦多糖得率的影响

从多糖提取的角度来说，中性蛋白酶可以水解与多糖结合的蛋白质，提高得率[16]。随着加酶量增加，荞麦多糖提取率迅速上升，1.000%时达到最大值，多糖得率为4.200%，而后出现下降。可能是由于随着增加酶的添加量，加深酶解程度，酶解液黏度增加，导致多糖附着各类杂质形成沉淀，影响荞麦多糖的得率[17]。因此，中性蛋白酶添加量1.000%时为最为适宜。

2.1.2 纤维素酶添加量的确定

纤维素酶添加量对荞麦多糖得率的影响见图2。

图2 纤维素酶添加量对荞麦多糖得率的影响

纤维素酶能破坏荞麦细胞壁，有利于提取荞麦多糖。随着添加量增加，得率先增加后减少。纤维素酶添加量为0.045%时，多糖得率最高；在0.045%～0.050%时，多糖得率开始下降，可能是因为酶分子饱和，不易结合底物，从而减缓了细胞壁的水解速度[18]。此外，过多的酶会增加体系黏度，阻碍荞麦多糖溶解，从而降低多糖得率。因此，纤维素酶添加量以0.045%为最宜，多糖得率为4.510%。

2.1.3 果胶酶添加量的确定

果胶酶添加量对荞麦多糖得率的影响见图3。

图3 果胶酶添加量对荞麦多糖得率的影响

由图3 可知，当果胶酶添加量到达0.035%时，荞麦多糖得率最高。在0.020%～0.035%时，荞麦多糖得率呈现上升趋势；当果胶酶添加量大于0.035%，荞麦多糖得率呈下降趋势。分析出现下降的现象，可能与上述出现的情况大致相同；也可能是体系中3 种酶的添加量变大时，导致各种酶之间出现拮抗作用[19]。果胶酶添加量为0.035%时，多糖得率为4.890%。

2.1.4 料液比的确定

料液比对荞麦多糖得率的影响见图4。

图4 料液比对荞麦多糖得率的影响

随料液比的变化，荞麦多糖得率呈先上升后下降的趋势，在料液比为1∶20（g∶mL） 时，出现得率峰值，为5.580%。分析其原因可能为1∶20（g∶mL） 之前，荞麦种子中的多糖未得到较好的溶解，才表现出多糖得率较低的现象。相反，当提取液剂量增大会导致提取率降低的现象。

2.1.5 pH 值的确定

pH 值对荞麦多糖得率的影响见图5。

图5 pH 值对荞麦多糖得率的影响

由图5 可知，荞麦多糖得率随着pH 值的增大而增大，当pH 值达到7.0 时多糖得率最大，达到5.740%左右；当pH 值继续增大，得率不再增加，反而会有所下降。可能是因为在其最适pH 值条件下，体系中的复合酶更易与底物结合，有利于酶促反应的发生[20-21]。

2.1.6 提取温度的确定

提取温度对荞麦多糖得率的影响见图6。

图6 提取温度对荞麦多糖得率的影响

由图6 可知，提取温度为30～60 ℃时，多糖得率随温度的升高而增大，在60 ℃时多糖得率出现峰值。在60 ℃以后，多糖得率又出现大幅度下降的现象，可能原因是溶剂中尚未溶解的荞麦粉末为60～70 ℃时发生糊化，高温影响多糖的结构和活性，导致多糖的变性；过高的温度导致体系中复合酶的变性失活，从而导致荞麦多糖的得率降低[22]。考虑到能源成本与复合酶活性问题，荞麦多糖的提取温度60 ℃时为最佳，此时荞麦多糖得率为6.400%。

2.1.7 超声功率的确定

超声功率对荞麦多糖得率的影响见图7。

图7 超声功率对荞麦多糖得率的影响

由图7 可知，随着超声功率的不断增大，荞麦多糖的得率呈现先逐渐增大后降低的现象。在超声功率为425 W 时多糖得率为7.500%，是各水平超声功率下的最高值，说明此功率下多糖可以得到最充分的溶解；在超声功率为200～350 W 时，多糖得率随功率的增加而增加，原因是随着超声功率的加大，荞麦植物组织细胞壁逐渐破碎，荞麦多糖逐渐溶于溶剂当中[23]；大于425 W 时，多糖得率出现下降趋势，可能是由于超声功率过大打断糖苷键，多糖结构被破坏，在后期收集中出现损失，从而导致荞麦多糖得率的下降[24]。因此，在超声提取荞麦多糖时，以超声功率425 W 较为适宜。

2.2 Plackett-burman 试验

采用Design Expert.V 8.0.6.1 对Plackett-burman试验设计与分析，对7 个影响因素进行显著性分析，以高水平（+1） 和低水平（-1） 表示，响应值为多糖得率。

Plackett-burman 试验设计及结果见表3，Plackett-burman 模型方差分析见表4。

表3 Plackett-burman 试验设计及结果

表4 Plackett-burman 模型方差分析

由表3 可知，中性蛋白酶添加量（A）、果胶酶添加量（C） 和超声功率（G） 对多糖提取影响显著（0.01＜p＜0.05）。因此，选择A、C、G作为最陡爬坡试验的考查因素。

2.3 最陡爬坡试验

从Plackett-burman 试验结果可知，A、C、G3个因素对试验结果影响较大且为负效应，因此适当降低各因素的水平，进行最陡爬坡试验，确定爬坡方向和合理步长，从而快速接近最佳区域[25]。

最陡爬坡试验设计与结果见表5。

表5 最陡爬坡试验设计与结果

由表5 可知，最佳的组合为试验号4，即中性蛋白酶添加量为0.900 0%，果胶酶添加量为0.032 5%，超声功率为425 W，故以试验号4 的条件为Boxbehnken 试验设计的中心值。

2.4 响应面试验

响应面试验设计与结果见表6。

表6 响应面试验设计与结果

2.4.1 响应面试验方差分析

以Plackett-burman 试验和最陡爬坡试验结果为基础，利用Design Expert.V 8.0.6.1 软件进行响应面试验方差分析。

响应面试验方差分析见表7。

表7 响应面试验方差分析

分析数据得方程：

由表8 可知，A，CG，A2，C2和G2极显著，C，AC和AG显著。影响荞麦多糖得率因素先后顺序为A＞C＞B。总体分析，回归模型p＜0.01，表明该模型极显著；同时，回归模型的失拟项不显著（p＞0.05），R2Adj=0.878 4，说明该模型能解释87.84%的响应值变化，可用于超声波辅助复合酶法提取荞麦多糖提取工艺优化。

2.4.2 两因素交互作用影响提取工艺的响应面分析

做出响应曲面，分析中性蛋白酶添加量（A）、果胶酶添加量（C）、超声功率（G） 对荞麦多糖得率的影响。

中性蛋白酶添加量、果胶酶添加量交互作用对多糖得率的响应面和等高线见图8，中性蛋白酶添加量、超声功率交互作用对多糖得率的响应面和等高线见图9，果胶酶添加量、超声功率交互作用对多糖得率的响应面和等高线见图10。

图8 中性蛋白酶添加量、果胶酶添加量交互作用对多糖得率的响应面和等高线

图9 中性蛋白酶添加量、超声功率交互作用对多糖得率的响应面和等高线

图10 果胶酶添加量、超声功率交互作用对多糖得率的响应面和等高线

由图8 ～图10 可知，响应面图评估三者之间交互作用对荞麦多糖得率的影响，曲面有极大值，工艺最优参数在试验范围内，等高线图近似于椭圆形，说明各因素交互作用较显著，与上表结果一致。

2.4.3 验证试验

以荞麦多糖得率为最终优化值，经Design Expert.V 8.0.6.1 软件预测可得最佳提取工艺为中性蛋白酶添加量0.900 0%，纤维素酶添加量0.045 0%，果胶酶添加量0.032 4%，料液比1∶20（g∶mL），pH值7.0，提取温度60 ℃，超声功率424 W，荞麦多糖得率为7.25%。为验证其可靠性，重复试验3 次，多糖平均得率为7.11%，相对误差为0.14%，与预测值基本一致。说明该模型可行，具有实际操作意义。

2.5 荞麦多糖体外抗氧化能力测定

2.5.1 荞麦多糖对DPPH 自由基清除能力

荞麦多糖及维C 对DPPH 自由基的清除作用见图11。

图11 荞麦多糖及维C 对DPPH 自由基的清除作用

由图11 可知，在0.2～1.0 g/mL 范围内，维C 对DPPH 自由基有较高清除能力，最高清除率可达94.89%。随着不断增加样品质量浓度，荞麦多糖对DPPH 自由基清除率呈上升趋势，在样品质量浓度为1.0 g/mL 时，荞麦多糖对DPPH 自由基清除率可以达到62.31%。整体来看，维C 对DPPH 自由基清除能力要强于荞麦多糖。

2.5.2 荞麦多糖对ABTS+自由基清除能力

荞麦多糖及维C 对ABTS+自由基的清除作用见图12。

图12 荞麦多糖及维C 对ABTS+自由基的清除作用

由图12 可知，低于0.6 g/mL 时，荞麦多糖对ABTS+自由基清除率大幅度上升，在0.6～1.0 g/mL，荞麦多糖对ABTS+自由基清除率上升缓慢，在1.0 g/mL时，达到最大清除率88.78%。相较于不同质量浓度荞麦多糖和维C 对ABTS+自由基的清除作用，在1.0 g/mL 时荞麦多糖的清除率更接近维C。由此可知，荞麦多糖对于ABTS+自由基有着良好的清除作用。

2.5.3 荞麦多糖铁离子还原能力

荞麦多糖及维C的还原能力见图13。

由图13 可知，随着样品质量浓度升高，维C的还原能力快速增加；荞麦多糖在各个质量浓度条件下的还原力均较弱于维C。在样品质量浓度为0.8 g/mL 时，荞麦多糖和维C的还原能力最为接近，分别是76.28%和96.99%。荞麦多糖还原能力最大值出现在1.0 g/mL 时，为76.76%。

3 结论

通过单因素试验、Plackett-burman 试验、最陡爬坡试验和Box-behnken 试验优化超声波辅助酶法提取荞麦多糖的最佳提取工艺。结果表明，中性蛋白酶添加量0.900 0%，纤维素酶添加量0.045 0%，果胶酶添加量0.032 4%，料液比1∶20（g∶mL），pH 值7.0，提取温度60 ℃，超声功率424 W，此结果可充分验证该试验模型的可靠性。对通荞3 号多糖进行了体外抗氧化能力研究，结果表明虽然多糖清除自由基和还原能力弱于维C，但是荞麦多糖对DPPH 自由基和ABTS+自由基有明显清除能力，并且对铁离子具有一定的还原性。该研究为荞麦多糖提取工艺提供了技术参考，为进一步开发和利用通辽当地荞麦资源提供了理论依据。