广东省市售灵芝及相关制品中灵芝总三萜含量监测结果分析

姚 敬，黄伟雄，龙朝阳，邵义娟，朱 盼，李 晖

（广东省疾病预防控制中心，广东 广州 511430）

灵芝属于担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，灵芝菌科，灵芝属[1]，是《本草纲目》中唯一被收录五经的药材，具有较高的药用价值[2]。灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子，是活体生物体，双壁结构，被坚硬的几丁质纤维素所包围，人体很难充分吸收，因此需要破壁或者去壁处理，才能发挥灵芝孢子粉最大的营养价值[3]。

灵芝孢子油是以破壁灵芝孢子粉经二氧化碳超临界萃取得到的脂溶性混合物，集成了灵芝孢子的多种活性成分[4]。随着对灵芝不断深入的科学研究，发现灵芝、灵芝孢子粉及灵芝孢子油化学成分复杂，主要包含三萜、甾体、多糖、生物碱、脂肪酸等多种化学成分[5-7]。

在各种活性化学成分当中，灵芝三萜由于其良好的药理活性，已逐渐引起人们的关注和重视，其中灵芝三萜类化合物在抗肿瘤方面的研究一直是灵芝药理研究的重点[8]。除了抗癌性外，研究还表明灵芝三萜类化合物在抗菌[9]、抗病毒[10]、抗氧化[11]、保护神经元[12]、保肝护肝[13]、降血糖[14]等方面具有较好的作用，但现阶段针对灵芝不同部位、不同生长阶段、破壁与未破壁孢子粉、灵芝孢子油的营养品质等方面的综合研究不多。

鉴于灵芝三萜具有多种药理活性，研究灵芝总三萜含量可作为评价灵芝药用价值的一个重要指标，采用科学测定方法确定灵芝中灵芝总三萜含量，对于建立灵芝质量标准、规范灵芝市场以及推动灵芝产业发展具有重要意义。

目前，我国规定的灵芝及灵芝孢子粉、孢子油等相关制品中总三萜测定方法及评价标准主要有《中国药典（2020 年版）》[15]、GH/T 1335—2021《灵芝孢子粉》[16]等，测定方法大致相同，其中区别主要在于提取溶剂及选取的对照品。

考虑到最终结果的可比性，研究采用统一的比色法系统地测定广东销售的灵芝及相关制品中灵芝总三萜含量，采用科学的方法对灵芝不同部位、不同生长阶段、破壁与未破壁孢子粉、灵芝孢子油中总三萜含量进行分析比较，为人群选择相关产品提供了参考数据，也为今后灵芝及相关制品的质量评价提供参考指标，并为其药理活性研究提供理论基础与试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

齐墩果酸对照品，大连美仑meilunbio（＞98%），lot：D0701AS，CAS：508-02-01；香草醛：香兰素，CNW，＞98%，CAS：121-33-5，lot：E324K024。其他试剂：乙醇、乙酸乙酯、高氯酸、甲醇、冰醋酸，均为分析纯，广州试剂厂提供。

样品来源：根据广东省卫生健康委办公室印发《广东省开展铁皮石斛等3 种按照传统既是视频又是中药材物质专项风险监测实施方案》的通知，采样点选择在广州、珠海、佛山、韶关、梅州、东莞、中山、江门、湛江、云浮共10 个地市辖区范围内的超市、药房、农贸市场、种植基地等居民主要采购地点。按照实施方案中简单随机抽样的方法，采集灵芝、灵芝孢子粉（包含破壁与未破壁）、灵芝孢子油3 类样品，其中所采集的破壁灵芝孢子粉均包装标称符合GB 29344—2012 《灵芝孢子粉采收及加工技术规范》要求，破壁灵芝孢子粉破壁率不得小于95%[17]。

1.2 仪器与设备

岛津UV-2660 型紫外分光光度计、Mettler Toledo ML204 型电子天平天平、Branson 2510 型超声波振荡器。

1.3 测定方法

最终结果需要在同一测定方法下得出才具有可比性，因此采用了适用于基质最为复杂、总三萜提取难度最大的灵芝的《中国药典（2020 年版）》中规定的总三萜测定方法分别对所采集到的灵芝及灵芝孢子粉、孢子油等相关制品中总三萜进行测定，并统一以齐墩果酸（C30H48O3） 作为对照品。具体步骤如下：

（1） 精密称取样品粉末或残渣状2 g，置于锥形瓶中，加入乙醇溶液50 mL，超声处理45 min，过滤，滤液置于100 mL 容量瓶中，用乙醇溶液分次洗涤滤渣，洗液并入容量瓶中，加入乙醇溶液定容至刻度，摇匀。

（2） 精密量取样品溶液0.2 mL，置于10 mL比色管中，挥干后加入香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，摇匀，在70 ℃水浴中加热15 min，立即置于冰水浴中冷却5 min，取出，加入乙酸乙酯4 mL，摇匀后使用紫外分光光度计于波长546 nm 处测定吸光度。

（3） 标准曲线的配制：精密称取齐墩果酸（C30H48O3） 对照品（cas：508-02-1，＞98%） 0.016 2 g，加甲醇溶液定容至100 mL 容量瓶，配制成质量浓度为0.159 mg/mL 的标准溶液。

（4） 再精密量取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 分别置于10 mL 比色管中，自上述“挥干”起与样品管同法操作，测定吸光度。

（5） 紫外分光光度计测定从标准曲线上读出样品液中齐墩果酸的含量，计算即得[15]。

1.4 评价标准

未破壁灵芝孢子粉是未进行人工破壁，人体很难充分吸收，仅是作为生产灵芝孢子粉产品的原料或中间物料而非最终产品，不适用于GH/T 1335—2021《灵芝孢子粉》中规定的适用范围，因此在研究中灵芝及未破壁灵芝孢子粉中总三萜参考《中国药典（2020 年版）》规定：以干燥品计算，含三萜及甾醇不得少于0.50%[15]。破壁孢子粉及孢子油中总三萜参考GH/T 1335—2021《灵芝孢子粉》规定：总三萜均应大于等于2%[16]。

1.5 数据处理方法

用Excel 建立数据库，用SPSS 21.0 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 灵芝及相关制品总三萜含量的检测情况

在广东地区采集了125 份灵芝及相关制品，总三萜含量为0.22%～29.4%，均值和中位值分别为3.11%和1.37%，其中低于《中国药典（2020 年版）》或GH/T 1335—2021《灵芝孢子粉》规定的有1 份灵芝样品和1 份灵芝孢子粉样品，总体不及格率为1.6%。

灵芝及相关制品总三萜含量见表1。

表1 灵芝及相关制品总三萜含量

对各类灵芝及相关制品总三萜含量进行单因素方差分析（ANOVA），方差齐性检验的p值为0，小于0.01，说明3 组方差不齐，因此采用非参数分析的独立样本Kruskal-Wallis 检除进行各组间两两比较，各组间的调整显著性均小于0.05，说明各类灵芝及相关制品总三萜含量间具有显著的统计性差异。

灵芝及相关制品总三萜含量的Kruskal-wallis 检验结果见表2。

表2 灵芝及相关制品总三萜含量的Kruskal-Wallis 检验结果

2.2 灵芝不同部位中总三萜含量的检测情况

在研究中，灵芝不同部位具体分为灵芝子实体（全只）、菌盖（灵芝片）、未破壁灵芝孢子粉，其中有一份灵芝子实体（全只） 和一份未破壁灵芝孢子粉的总三萜含量低于《中国药典（2020 年版）》规定的0.5%。

灵芝不同部位中总三萜含量见表3。

表3 灵芝不同部位中总三萜含量

对灵芝不同部位中总三萜含量进行单因素方差分析（ANOVA），方差齐性检验的p值为0，小于0.01，说明3 组方差不齐，因此采用非参数分析的独立样本Kruskal-wallis 检除进行各组间两两比较，灵芝子实体- 菌盖间的调整显著性为0.873，灵芝子实体- 未破壁灵芝孢子粉和菌盖- 未破壁灵芝孢子粉间的调整显著性均小于0.05，说明灵芝子实体与菌盖间的总三萜含量没有显著性差异，未破壁灵芝孢子粉中总三萜含量与另外两者间具有显著的统计性差异。

灵芝及相关制品总三萜含量的Kruskal-Wallis 检验结果见表4。

表4 灵芝及相关制品总三萜含量的Kruskal-Wallis 检验结果

2.3 不同生长阶段子实体中总三萜含量的检测情况

灵芝子实体的不同阶段分为菌蕾期（刚长出菌袋切口的幼嫩灵芝）、成熟期（成熟但未弹粉的子实体）、弹粉期（开始弹粉后的子实体），其中有1 份菌蕾期子实体的总三萜含量低于《中国药典（2020年版）》规定的0.5%。

不同生长阶段子实体中总三萜含量见表5。

表5 不同生长阶段子实体中总三萜含量

对不同生长阶段子实体中总三萜含量进行单因素方差分析（ANOVA），方差齐性检验的p值为0.372，大于0.01，说明3 组方差齐性；单因素方差分析结果的p值为0.135，大于0.01，说明3 组结果无显著性差异。

2.4 不同灵芝孢子粉中总三萜含量的检测情况

在广东地区合计采集了45 份灵芝孢子粉，总三萜的含量在0.22%～3.85%，均值和中位值分别为2.70%和3.23%。在采集的灵芝孢子粉中，未破壁灵芝孢子粉的总三萜的含量均值和中位值分别为1.72%和1.53%，破壁灵芝孢子粉均值和中位值分别为3.42%和3.49%，且未破壁灵芝孢子粉中有1 份样品的总三萜含量低于《中国药典（2020 年版）》规定的0.5%。

未破壁与破壁灵芝孢子粉中总三萜含量见表6。2 种灵芝的总三萜含量间的差异采用独立样本t检验进行分析，方差齐性检验中显著性p值为0.001，小于0.05，说明2 组数据方差齐性，从均值检验中查看显著性p值（双侧） 为0，小于0.05，未破壁与破壁灵芝孢子粉中总三萜含量具有显著性差异。

表6 未破壁与破壁灵芝孢子粉中总三萜含量

3 结论

研究结果显示，广东市售的各类灵芝及相关制品中总三萜含量基本符合《中国药典（2020 年版）》或GH/T 1335—2021《灵芝孢子粉》的规定，不合格率仅为1.6%。不同种类间的灵芝及制品中总三萜含量具有显著性的差异：灵芝中总三萜含量低于灵芝孢子粉，而远低于灵芝孢子油。

通过对灵芝不同部位的总三萜含量进行统计分析可知，灵芝子实体和菌盖的总三萜含量并无显著性差异，但均低于未破壁灵芝孢子粉的总三萜含量。而柳小兰等人[18]指出，灵芝子实体（整支） 和灵芝孢子粉（未破壁） 间总三萜含量无显著差异，此结果与本试验有一定差异，推测与灵芝品种、栽培方法、栽培环境等因素有关。

通过对不同生长阶段的灵芝子实体的总三萜含量进行分析可知，子实体不同生长阶段三萜含量间呈显著性差异，含量比较稳定，各生长阶段间差异不大。针对孢子粉破壁与否的对比分析可知，破壁灵芝孢子粉的总三萜含量更高，表明破壁技术对灵芝营养成分含量有很大影响，与前人的研究结果相符[19-20]。

综上所述，广东销售的灵芝及其制品中总三萜含量基本都符合相关要求。作为人体摄入灵芝总三萜的来源，灵芝子实体和灵芝片无明显差异。若在经济条件允许的条件下，灵芝孢子粉和灵芝孢子油是补充灵芝总三萜的更好选择，其中破壁灵芝孢子粉的效果要优于未破壁灵芝孢子粉。