响应面法优化核桃分心木总黄酮提取工艺研究

刘 静，叶朋飞，张春艳，黄慧福

（1.曲靖职业技术学院，云南曲靖 655011；2.曲靖师范学院，云南曲靖 655011）

0 引言

核桃是胡桃科、胡桃属的一种植物，我国是世界核桃生产大国，拥有最大的种植面积和产量。分心木为其副产物，是胡桃科核桃属植物核桃的果核内木质隔膜，颜色呈棕色至浅棕褐色，又称核桃隔膜[1-4]。分心木，体轻、质脆、易折断，呈薄片状，约占核桃总质量的4%～5%[5-6]。核桃分心木具有味涩、性平的特点，能够入脾胃，对肾虚遗精[7]、口腔溃疡[8]、牙龈出血[9]、失眠[10]等症状有疗效，兼具药食两用价值。此外，核桃分心木还具抑菌[11]、抗氧化[12]、降血糖[13]、抑制脑功能衰退[14]、抗肿瘤[15]等作用。

云南核桃栽培历史悠久，云南省16 个地、州市，129 个县、市、区均有分布及栽培。核桃产业是云南省发展高原特色农业中的优势产业，种植面积全国第一，占43%。核桃是木本一种油料树种，综合利用经济价值很高，在脱贫致富的道路上发挥了巨大作用。每加工1 000 kg的核桃，就产生50 kg的核桃分心木副产物被当作废弃物处理，造成环境的污染和资源的浪费。核桃分心木富含黄酮[16-17]、多酚[18]、多糖[19]等多种活性物质，其中黄酮类化合物在核桃分心木中含量较高，且具有光谱药理活性，无毒无害[20]，是目前国内外研究的热点。目前，关于核桃分心木黄酮提取方法的研究较少，采用超声辅助提取法能使植物中的成分更好地溶出，相较于传统的提取工艺，提取率更高[21]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃，购自保山市；芦丁标准品（纯度：HPLC≥98%），成都麦德生科技有限公司提供；无水乙醇（AR），天津市大茂化学试剂厂提供；硝酸钠（AR）、硝酸铝（AR），天津市风船化学试剂科技有限公司提供；氢氧化钠（AR），西陇化工股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

UV5100 型可见分光光度计，安徽皖仪科技股份有限公司产品；CR-060S 型超声波清洗器，深圳市春霖清洗设备有限公司产品；TDL5A 型离心机，常州市金坛友联仪器研究所产品。

1.3 试验方法

1.3.1 总黄酮提取工艺

核桃分心木于50 ℃下烘干，粉碎、过筛，备用。准确称取1.000 0 g 核桃分心木粉末，按照一定的液料比，加入不同体积分数的乙醇溶液，在超声波辅助条件下提取一定的时间，采用NaNO2-Al(NO3)3显色法于波长510 nm 处测定分心木提取液中总黄酮的吸光度[22]。

1.3.2 总黄酮得率的计算

（1） 标准曲线的建立。配制质量浓度0.1 mg/mL的芦丁标准液备用。取芦丁标准品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分别加入质量分数为5%的NaNO2溶液0.5 mL，摇匀、放置6 min 后，加入质量分数为10%的Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀放置6 min，再加入质量分数为4%的NaOH 溶液4 mL 快速定容摇匀，静置15 min 后，于波长510 nm 处测定总黄酮提取液的吸光度。以吸光度（A） 为因变量，芦丁溶液质量浓度（C） 为自变量绘制标准曲线[23]。

（2） 总黄酮含量的测定。取待测液1 mL，按

1.3.2（1） 的方法测定，同时做空白，核桃分心木中总黄酮的提取率按下式计算：

式中：C——提取液中总黄酮质量浓度，mg/mL；

V0——样品提取液体积，mL；

V1——提取液样品测定定容体积，mL；

V2——测定用样液体积，mL；

M——样品质量，g。

1.3.3 单因素试验

（1） 料液比对提取率的影响。选取料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL），在乙醇体积分数40%，超声温度为40 ℃的条件下提取40 min，分析料液比对总黄酮提取率的影响。

（2） 超声时间对提取率的影响。选取超声时间为20，30，40，50，60 min，在料液比为1 ∶50（g∶mL），乙醇体积分数为40%，超声温度为40 ℃的条件下，分析超声时间对总黄酮提取率的影响。

（3） 超声温度对提取率的影响。选取超声温度为20，30，40，50，60 ℃，在料液比为1∶50（g∶mL），乙醇体积分数为40%，超声时间为50 min 条件下，分析超声温度对总黄酮提取率的影响。

（4） 乙醇体积分数对提取率的影响。选取乙醇体积分数为20%，30%，40%，50%，60%，在料液比为1∶50（g∶mL），超声温度为40 ℃，超声时间为50 min 的条件下，分析乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验的基础上，选取料液比（A）、超声时间（B）、超声温度（C）、乙醇体积分数（D）为自变量，以总黄酮的提取率为响应值，优化核桃分心木总黄酮的提取工艺[24-25]。

响应面设计因素与水平设计见表1。

表1 响应面设计因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 标准曲线的确定

以吸光度为因变量，芦丁溶液质量浓度为因变量，绘制标准曲线（Y=12.799X-0.004 4，R2=0.999 8）。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 最佳料液比的确定

料液比对总黄酮提取率的影响见图1。

图1 料液比对总黄酮提取率的影响

由图1 可知，核桃分心木总黄酮的提取率随着料液比的增加，先上升后下降，是因为料液比的增加增大了核桃分心木总黄酮的溶解力，使得提取率增大。当料液比过大时，核桃分心木中非黄酮类物质溶出，导致提取率下降[26]。因此，料液比选择为1∶50（g∶mL）。

2.2.2 最佳超声时间的确定

超声时间对总黄酮提取率的影响见图2。

图2 超声时间对总黄酮提取率的影响

由图2 可知，超声时间对总黄酮的提取率有一定的影响，随着超声时间的延长总黄酮的提取率在50 min 之前逐渐增加，之后提取率下降。因此，超声时间选择为50 min。

2.2.3 最佳超声温度的确定

超声温度对总黄酮提取率的影响见图3。

图3 超声温度对总黄酮提取率的影响

由图3 可知，总黄酮的提取率随温度的升高先上升后下降，在40 ℃提取率达到最大。可能是由于温度的升高会破坏不稳定的黄酮分子的结构使得提取率下降[27]。因此，选择40 ℃的超声温度为宜。

2.2.4 最佳乙醇体积分数的确定

乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响见图4。

图4 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

由图4 可知，总黄酮的提取率在乙醇体积分数为40%以前逐渐增加，之后提取下降。分析其原因为，当体积分数过大时，部分醇溶性杂质会被溶出，以致于总黄酮的提取率下降。因此，选择40%的乙醇体积分数选择为宜。

2.3 响应面试验结果及分析

2.3.1 响应面试验结果

以核桃分心木总黄酮的提取率为响应值，通过Design Expert 8.0 对表2 的数据进行分析，得拟合方程为：

表2 响应面试验结果

响应面试验结果见表2。

2.3.2 方差分析

方差分析见表3。

表3 方差分析

由表3 可知，模型的p＜0.000 1，失拟项p值为0.050 7 不显著，模型的决定系数R2为0.961 7，说明可以利用该方程确定核桃分心木总黄酮提取率的最佳工艺参数。各因素对核桃分心木总黄酮提取率的影响顺序为D＞A＞C＞B。

各参数之间的交互作用可由响应面法中的三维空间曲面图形象地反映出来。响应面中的曲线越弯曲说明研究因素对结果的影响越大。等高线呈现圆形时，说明两因素交互作用不显著；等高线呈现椭圆时，两因素交互作用显著。

两因素交互作用对总黄酮提取率的响应面曲线和等高线图见图5。

图5 两因素交互作用对总黄酮提取率的响应面曲线和等高线图

由图5 可知，A与B、A与C、A与D的等高线图均趋于椭圆形，说明交互作用显著；B和C、B和D、C和D的等高线图均趋于圆形，说明交互作用不显著。

2.4 最佳工艺及验证试验

通过响应面分析软件确定料液比1∶54（g∶mL），超声时间50 min，超声温度41 ℃，乙醇体积分数43%为核桃分心木总黄酮工艺的最优条件，总黄酮的提取率为7.87%。在此条件下进行3 次平行验证试验，所得总黄酮的提取率为7.78%，与预测值相差不大，说明该模型可靠性强。

3 结论

超声波辅助提取法经济、实用，提取率高，且不会破坏有效成分，结合响应面法优化总黄酮提取的最优条件为料液比1∶54（g∶mL），超声时间50 min，超声温度41 ℃，乙醇体积分数43%，总黄酮的提取率为7.78%。