牛病毒性腹泻诊断方法研究进展

刘育含，李 琦，张 娜，杨裕坤

1.临江市畜牧总站，吉林临江 134600；2.临江市花山镇综合服务中心，吉林临江 134600；3.临江市动物疫病预防控制中心，吉林临江 134600

牛病毒性腹泻（BVD）可引起牛黏膜感染，腹泻，及母牛流产等症状，是一种高度接触性、自限性的传染病。牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是一种主要感染牛、羊、猪等哺乳动物的重要传染性病原体，由于BVDV 在全球广泛流行，给全球养牛业造成重大经济损失。因此，BVDV 的准确诊断对于该病的防治意义重大。近年来，BVDV 诊断方法也在不断发展和完善，本文对目前应用较广泛的BVDV 诊断方法进行了概述，为牛病毒性腹泻的诊断和防治提供了理论依据。

1 BVDV 病原学特征及流行病学

BVDV 于1946 年在纽约首次被发现和分离，自此，BVDV 开始在世界各地被发现。目前，许多国家的感染情况十分严重，BVDV 血清阳性率已达到50%以上。BVDV 血清阳性率在北美国家为75%～84%，在中东国家为14% ～15%， 在南美国家为22.2%～90%，在欧洲国家为53.27%～18.19%，在亚洲国家为7%～20.21%，在澳大利亚超过89%。BTM BVDV Ab 的检测还可以确定奶牛群的整体抗体状态，可以替代血清学样本的检测方法，降低流行病学调查的成本。例如，爱尔兰BTM BVDV 抗体的阳性率高达73%。近年来的分子流行病学调查结果也证实了BVDV 在多基因型中的广泛流行，这给当前BVDV 的防控带来了困难。亚型的患病率因地区而异。在美国，已经确定了三种主要亚型（BVDV-1a、1b 和BVDV-2a）。PI 动物主要持续感染BVDV-1b。在波兰流行的基因型主要有BVDV-1b 和1d 两种。土耳其和阿根廷具有相同的流行亚型，主要是BVDV-1a，1b 和BVDV-2。在中国，基因型BVDV-1b、BVDV-1m 和BVDV-1q 最为普遍。然而，以前的大多数研究都涉及中国西部的肉牛和牦牛。目前尚无关于中国西部大型奶牛场BVDV 患病率的系统报告。

BVDV-1 和BVDV-2 这两个毒株属于黄病毒科中的瘟病毒属，与人类丙型肝炎病毒（HCV）基因组同源。目前，国际病毒分类委员会（ICTV）认可了4 种已知的瘟病毒物种：猪瘟病毒（CSFV）、边境病毒（BDV）、BVDV-1 和BVDV-2，是有囊膜的单股正链RNA 分子,全长约12.3 kb，基因组两端为非编码区，仅有一个开放阅读框，编码一个大多聚蛋白，在酶的作用下形成4 种结构蛋白和8 种非结构蛋白。目前对于BVDV 的研究多集中在非结构蛋白的E2 蛋白编码区，因为E2 蛋白编码区是BVDV 基因组内变异性最高的区域之一，编码区的变异会直接影响到病毒的诊断结果以及对应编码区疫苗的效用，所以要对其进行持续性研究。

牛病毒性腹泻是危害养牛业严重疾病之一，它被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告动物疾病，在中国被列为三类动物疾病。自1980 年BVDV 首次从中国分离出来以来，大量流行病学调查显示中国大部分地区都出现过BVDV 感染。

持续感染的牛是病毒传播的主要来源，急性感染的牛以及其它反刍动物，无论是急性感染还是持续感染，都可能传播病毒。直接接触的传播效率最高。不同地区牛病毒性腹泻患病率的差异或在以前没有BVDV 的畜群中引入病毒通常与特定的流行病学因素有关，例如牛群密度，动物交易及放牧。根据感染病毒株的牛群免疫状态和致病性，感染BVDV引起的经济损失程度不同。将感染引入完全易感的牛群会造成严重的损失，感染高毒力BVDV 毒株会导致严重的临床症状和急性感染后的死亡，也造成重大的经济损失。因此，控制计划的成本效益分析高度依赖于不同情况下新感染的风险以及所涉及的病毒株。

2 诊断方法

2.1 临床诊断

牛病毒性腹泻潜伏期为7 ～14 d，牛病毒性腹泻按临床表现可分为两种类型：急性型和慢性型。慢性型病牛会出现明显的急性高热，以及不同程度的黏膜病变，例如：鼻镜糜烂、口腔糜烂、齿龈发红、眼角产生浆液性分泌物。慢性病牛由于蹄叶炎和趾间皮肤糜烂坏死常导致跛行。患病后2 ～6个月死亡，也存在少数病例病程超过一年。妊娠母牛感染BVDV 后，会导致流产，同时幼牛犊发生先天免疫缺陷、小脑发育不全等，在妊娠后期感染BVDV，还会导致母牛产下免疫耐受的持续性感染（Persistently infected，PI）小牛，临床无明显症状，但免疫水平低下，且持续向牛群释放病毒，成为重要的传染源，因为它们持续、大量地排出BVDV。病毒又可感染多个器官系统，BVDV 感染也会影响动物的免疫力，使动物更容易感染其他疾病，所以牛病毒性腹泻往往发生在大型牛群中。由于BVDV 引起的临床症状区别很大，症状范围可从亚临床症状到高死亡率的急性感染。所以想确诊患病牛所感染的病毒种类，还需继续进行实验室诊断。

2.2 病毒分离

病毒分离培养多用于新病毒出现无法界定种属时以及多病毒共同感染时，整个操作过程对于实验室硬件设施要求较高，实验周期较长，病毒分离率较低，一般不用大规模检测。可将样本进行抗生素处理后，接种至细胞、鸡胚或动物体中，若实验条件合理，病毒将发生增殖，增殖后可进行病毒的鉴定及病毒感染性的定量测定。BVDV 在不同的毒株之间有着明显的遗传和抗原异质性特征，根据BVDV是否使细胞病变将其分为致细胞病变型和非致细胞病变型。通常情况下，分离牛病毒性腹泻病毒最常用到的细胞为MDBK 细胞，阿根廷学者A C Odeón 分别 用MDBK、BoTur、BHK-21、RD-420、NCL-1、PKZ等细胞系进行BVDV 病毒的体外扩增，评估细胞系、收获时间和感染方案的效果。发现MDBK 和BoTur细胞系易受感染，而BHK-21 和PKZ 则不然，但病毒感染后期会在MDBK 和NCL-1 中发生更稳定的增殖。

2.3 酶联免疫吸附试验抗体检测（ELISA）

ELISA 方法是当下较常用的一种血清学诊断方法，操作简单、特异性好，但是制备相应的特异性抗原一直是技术难点，韩美婧[1]以BVDV 全病毒基因为免疫原，成功筛选出抗BVDV 结构蛋白的单克隆抗体，建立ELISA 诊断方法，经条件优化和验证，该方法可信度高。

2.4 环介导等温扩增（LAMP）

LAMP 是一种对设备要求不高，具有简单高效、灵敏度强、特异性强、经济适用等优点，在发展中国家基层测试试验中具有良好应用前景，更适合实验条件有限的实验室使用的核酸扩增技术。赵洋等针对BVDV 保守区域BVDV5′UTR 设计RT-LAMP 特异性引物，优化条件后成功建立BVDV RT-LAMP 检测方法，灵敏度为1×102copies/µL。

2.5 实时荧光定量PCR

PCR检测方法是牛病毒性腹泻检测的“金标准”，多种PCR 方法包括巢式PCR、多重诊断PCR、实时PCR 等，都具有良好的稳定性以及时效性，其中实时荧光定量PCR 近些年发展迅速，该诊断方法自动化程度高，操作简单，灵敏度高，特异性强，结果也更加直观易分析。徐晓琪[2]建立了可区分牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、赤羽病病毒的多重荧光定量PCR 检测方法，其中牛病毒性腹泻病毒的最低检出限为3.5 copies/µL，可用于快速诊断牛繁殖障碍等症状的感染病原种类。麻宝艺[3]等建立了可以快速检测牛病毒性腹泻病毒1型和2 型的双重荧光定量PCR 检测方法。

2.6 微滴氏数字PCR

数字PCR 是一种新型核酸定量检测方法，通过制备微滴，将核酸模板包裹至微滴中，每个微滴内核酸模板数少于或者等于1 个，再次扩增后，每个包含核算模板的微滴都可以检测出荧光信号，可以做到绝对定量。王旭东[4]等根据NCBI 已发表的BVDV 序列，设计扩增引物，连接至pUC-T 载体上，制备阳性标准品，再次设计引物探针，优化条件，最终建立BVDV 检测数字PCR，最低检出限为1.9 copies/µL。

3 预防与控制

牛病毒性腹泻病毒很难在体外环境长时间生存，但在低温条件下可保持一定的稳定性，冻干后真空保存于-60 ～-70 ℃可以存活数年，在26 ～37 ℃温度条件下可生存24 h，但基本丧失活性，在56 ℃下数分钟内就将完全丧失活性[5]。

BVDV 的防控主要取决于几个因素，包括对病毒株和变异株的严格和持续监测，开发具有高通量检测能力的最新诊断方法以及开发同源疫苗。虽然我国自主研发的BVDV 疫苗已经上市，但都属于BVDV-1 基因型，因此建议在我国开展BVDV-2 基因型联合免疫或开发BVDV-1 和BVDV-2 基因型联合疫苗,且病毒性腹泻的反复流行说明该疾病的受重视程度仍有待提高，若可以联动政府、行业、企业及养殖户，多方共同努力，加强对牛病毒性腹泻的认知，制定牛病毒性腹泻控制计划或出台行业规范，严格的把控预防、养殖、流通以及患病后处理等多个环节，努力实现牛病毒性腹泻的基本控制。