L- 肉碱对海水小球藻叶绿素及铁、镁元素含量的影响

◆作者：邵盛男 张志超 邹京京 陈玉珂 穆道运

◆单位：1.中国水产科学研究院东海水产研究所；2.吉林农业大学动物科学技术学院

海 水 小 球 藻（marine Chlorella sp.）是绿藻门（Chlorophyta）小球藻属（Chtorella）的普生性单细胞绿色微藻，呈球形或椭球形，其细胞内富含脂质、蛋白质、色素等营养物质。由于小球藻具有的生物活性和抗氧化性，其广泛应用于养殖、食品、医药、纺织等领域。

L- 肉碱（L-carnitine）又称维生素Bt，学名β-羟基γ-三甲铵丁酸，是由赖氨酸和蛋氨酸作为前体物质合成的一种类氨基酸。L- 肉碱广泛存在于动植物中，其中在动物体内L- 肉碱可通过日粮途径及内源合成获得，植物组织中含量普遍低于动物组织，研究表明，L- 肉碱也存在于生物饵料中，但相对含量较低（Dong MZ 等，2006）。L- 肉碱可促进长链脂肪酸进入线粒体进行β- 氧化，以及清除线粒体中多余的短链和中链脂肪酰基CoA。同时它还具有提高抗氧化能力、增强免疫、促进幼体发育等作用（Kolodziejczyk J 等，2011）。

本研究在前人相关研究基础上，探究不同浓度L- 肉碱对小球藻促生长的作用机理。旨在为L- 肉碱在微藻培养以及应用领域提供参考，同时为天然色素生产技术提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

海水小球藻由中国海洋大学藻种库提供。试验所用试剂：L- 肉碱购自Sigma 公司（产品代号c-0158）；镁单元素标准溶液（GSB 04-1735-2004）、铁单元素标准溶液（GSB 04-1726-2004）购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；浓硝酸、N,N- 二甲基甲酰胺、人工基础海水及f/2培养基所用试剂均为分析纯；试验用水均为蒸馏水。

1.2 主要仪器与设备

光照培养箱（HPG-400BX）、冷冻高速离心机（HITACHI CR21N）、全功能微孔板检测仪（Biotek Synergy H1）、原子吸收光谱仪（Agilent 3510）、电子分析天平（BSA124S-CW）、超声波清洗仪（Auto Science AS）、超净工作台（SW-CJ-2FD）等。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

接种前对试验用具及培养基进行灭菌处理。采用f/2 培养基及人工基础海水作为营养源，接种后待培养体系稳定后分别添加浓度0、5、50、100、200 mg/L的L- 肉碱。在光照培养箱恒温条件下，温度25±1 ℃，光照强度4000 lx，光暗比24 h∶0 h，2 L培养体积，培养10d，试验期结束后使用冷冻高速离心机收集海水小球藻样品，-80 ℃保存备用。

试验人工基础海水成分和选用f/2 培养基见表1 和表2。

1.3.2 叶绿素含量的测定

试验结束后，每组取20 mL藻液4 ℃条件10000 r/min 离心10 min，去除上清，加入5 mL 的N,N- 二甲基甲酰胺于收获的藻样品中，重新悬浮后，置于黑暗条件下4 ℃浸提24 h。样品5000 r/min 离心10 min。测定样品及空白样品647 nm 和664.5 nm 处OD 值（Chen X 等，2016）。

1.3.3 铁、镁含量的测定

1.3.3.1 样品处理及测定

称取适量藻泥于坩埚65 ℃烘干至恒重，重新称重统一每组干燥的藻细胞重量，碳化至无烟后，550 ℃灰化完全后，待温度降低取出，加入1 体积浓硝酸与1体积水配制成的溶液5 mL 溶解沉淀，重复2 次将沉淀完全洗入容量瓶，蒸馏水定容至100 mL待测，调节Agilent 3510 型原子吸收光谱仪至最佳状态，载气为乙炔，设置铁、镁空心阴极灯在248.3 nm、285.2 nm 波长处检测元素浓度。

1.3.3.2 标准曲线制作

将1000μg/mL 的铁、镁标准溶液，使用蒸馏水配置成标准系列溶液，铁为：0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL；镁为0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6μg/mL。测定方法保持与样品一致，得出回归方程和相关系数，见表3。

表3 金属元素回归方程及相关

1.4 统计分析

采用方差分析法比较试验所得数据。应用Tukey 多重比较检验比较各处理组间均值的差异显著性，差异显著性水平P值设在0.05。数据均采用SPSS 20.0 软件进行分析，GraphPad Prism 5.0 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 L- 肉碱对海水小球藻叶绿素含量的影响

图1 所示，在一定浓度范围内，叶绿素a 含量随L- 肉碱浓度先增加后降低，5 mg/L 肉碱组海水小球藻叶绿素a 含量显著高于对照组及其他处理组（P＜0.05），100 mg/L 肉碱组中海水小球藻叶绿素a 含量显著低于5 mg/L 以及50 mg/L 肉碱组（P＜0.05），200 mg/L 肉碱组中海水小球藻叶绿素a 含量高于100 mg/L 肉碱组，但差异不显著（P＞0.05）。

图1 L- 肉碱对海水小球藻叶绿素a 含量的影响

图2 所示，在一定浓度范围内叶绿素b 含量随L- 肉碱浓度先增高后降低，总体趋势与叶绿素a 含量相似，5 mg/L 肉碱组海水小球藻叶绿素b 含量显著高于对照组及其他处理组（P＜0.05），100 mg/L 肉碱组中海水小球藻叶绿素b 含量显著低于5 mg/L 以及50 mg/L 肉碱组（P＜0.05），海水小球藻中叶绿素b 含量要低于叶绿素a 含量。

图3 所示，在一定浓度范围内总叶绿素含量随L- 肉碱浓度先增高后降低，5 mg/L 肉碱组中海水小球藻总叶绿素含量最高，100 mg/L 肉碱组中海水小球藻总叶绿素含量最低，在5～100 mg/L 的L- 肉碱浓度范围内总叶绿素含量随肉碱浓度增高而降低，200 mg/L 肉碱组总叶绿素含量高于100 mg/L 肉碱组，但差异不显著（P＞0.05），且略低于对照组。

图3 L- 肉碱对海水小球藻总叶绿素含量的影响

2.2 L- 肉碱对海水小球藻金属元素铁、镁含量的影响

图4 所示，在5～100mg/L范围内，金属元素铁的含量随着L- 肉碱添加浓度的增加而减少，5、50、100、200 mg/L 组 间 铁含量差异显著（P＜0.05），其中5、50 mg/L 肉碱组铁含量显著高于对照组，两组间差异显著，100 mg/L 肉碱组铁含量高于对照组但 无 显 著 差 异（P＞0.05），200 mg/L 肉碱组铁含量显著低于对照组（P＜0.05）。

图5 所示，在5～100mg/L范围内，海水小球藻中镁元素含量随着L- 肉碱添加量的增加而减少。5 mg/L 肉碱组海水小球藻中镁元素含量显著高于对照组和200 mg/L 肉碱组（P＜0.05），其中5 mg/L 肉 碱 组 与50 mg/L、100 mg/L 肉碱组之间无显著差异（P＞0.05），200 mg/L 肉碱组镁含量低于对照组但无显著差异（P＞0.05）。

图5 L- 肉碱对海水小球藻镁元素含量的影响

3 讨论

3.1 小球藻在水产养殖业中的应用

小球藻在水产养殖业中的应用十分广泛。首先，小球藻含有天然免疫物质和促生长物质，可以提高生产性能和机体免疫力，降低饲料消耗（Dalmo,R 等，1996），是我国水产养殖业广泛使用的优良饵料藻及饲料添加剂。蔡荣等（2017）研究表明，饲料中添加小球藻醇提物对于提高花鲈的生产性能、改善体组成有一定的作用。何亚丁等（2014）研究发现，小球藻藻渣可以部分替代凡纳滨对虾饲料中的豆粕，降低豆粕的用量，而不影响凡纳滨对虾的生长和氮排放，并降低磷排放。常洪淼（2022）研究发现，新型高蛋白小球藻替代鱼粉没有对虹鳟的生长、代谢和肠道健康造成明显的负面影响，具备大比例替代虹鳟饲料中鱼粉的潜力。其次，小球藻在水质调控方面也有良好效果，如在水产动物养殖系统中，小球藻对于维持水体生态系统的正常功能以及水环境的稳定具有重要作用（王崇明等，1993）。在对凡纳滨对虾（宋楚儿等，2023）以及罗非鱼（秦璐等，2021）的养殖尾水投放一定浓度的小球藻进行水质净化实验后发现，其对氨氮、磷酸盐和硝酸盐的去除效果较好，并可以调节水体微生物的群落结构，从而改善养殖水体水质状况。此外，小球藻代谢可以合成多种色素，如叶绿素、叶黄素、虾青素等，能起到改善水生动物体色，提高鱼类肌肉质量，保护虾蟹幼体发育等作用。并且由于小球藻所产生的是天然色素，因此还具有色价高、稳定性好、抗氧化性高以及安全健康的特征（苏力德，2011）。有研究发现在饲料中添加适量的虾青素能防止低密度脂蛋白氧化，并且对水生动物的生产无任何不利影响（Matsuno T 等，1990）。在饲料中添加一定的天然叶黄素也可以使水产动物呈现出靓丽鲜艳的自然健康颜色，同时还可以改善部分水产动物抗氧化指标以及生长性能（曾胡龙等，2021）。

培养高品质小球藻对水产养殖的意义十分重大，具有重要的应用前景。可以通过营养强化，调节藻色素组成来强化小球藻。同时提高小球藻运输、保存的质量，以促进小球藻规模化生产（葛玲瑞等，2022）。

3.2 L- 肉碱在水产养殖业中的应用

L- 肉碱是一种具有多种生理功能和生物活性的新型无公害添加剂。对动物体来说，补充肉碱与补充其它维生素及矿物质具有同样的重要性，目前肉碱的使用已受到普遍关注并广泛应用于水产动物、猪、禽的养殖中。众多研究表明，在养殖动物中添加适量的L- 肉碱可以提高动物饲料利用率和生产性能，改善肉品质，提高动物的抗病力。

在水产养殖中，L- 肉碱作为饲料添加剂对养殖动物的生长、脂代谢、抗氧化及免疫方面都发挥着重要作用。鱼类方面，陈玉珂等（2012）研究表明，适宜质量浓度L- 肉碱强化的卤虫投喂草鱼和鳙鱼开口苗提高了鱼苗体内多聚不饱和脂肪酸（PUFAs）的含量，这对促进鱼开口苗生长有重要作用。然而也有部分研究表明，饲料中添加L- 肉碱对鱼类生长、蛋白质利用率和饲料转化率无明显影响，如杂交条吻鲈、大菱鲆、黄颡鱼、黑鲷、大口黑鲈、欧洲鲈和初始体重为（151.00±1.69）g 的虹鳟（于婷等，2019）。Sabzi 等（2017）研究表明，饲料中添加L- 肉碱能够改善高脂饲料鲤鱼幼鱼体质并抑制脂质过氧化；许多研究也表明，在饲料中添加L- 肉碱能降低不同鱼类的脂质含量并增加蛋白质含量，或降低组织和全身的蛋白质分解代谢，显示出显著的蛋白质储留效果。明建华等（2013）研究发现，添加L- 肉碱可显著提高青鱼血清溶菌酶活性及补体C3 和C4 水平，从而增强鱼体的非特异性免疫力。同时，L- 肉碱对甲壳类动物的生长和风味也具有促进作用，Sabrina 等（2009）研究发现，在沼虾的饲料中添加L- 肉碱可以加速其脂肪酸的β氧化，促进对脂类的利用。吴成福等（2008）研究发现，添加L- 肉碱能提高斑节对虾肌肉肌苷酸含量，增加对虾鲜味作用，且低浓度肉碱的添加组效果更佳。

3.3 不同浓度L- 肉碱对海水小球藻叶绿素含量的影响

在小球藻细胞中，叶绿素镶嵌在叶绿体的类囊体膜中，是其进行光合作用的重要物质，小球藻细胞中叶绿素主要由叶绿素a、叶绿素b 组成。在光合作用中，绝大部分叶绿素的作用是吸收及传递光能，但只有少数处于激发状态的叶绿素a 可以将光能转化为电能，叶绿素b 通过吸收光能辅助光合作用。对于人体，叶绿素具有辅助造血、提供维生素、维持酶活性、解毒等作用（张怀斌，2008）。

已有研究表明，L- 肉碱可以促进微藻种群增长。林伟杰（2016）研究表明L- 肉碱能够提高海水小球藻对N、P 和Fe 营养盐吸收率的同时增加小球藻叶绿素a 的含量，此次试验结果表明不同浓度L- 肉碱对海水小球藻叶绿素含量均有影响。在一定的浓度范围内，海水小球藻叶绿素含量随L- 肉碱浓度呈现先升高后降低的趋势。在L- 肉碱浓度为5 mg/L 时肉碱组海水小球藻叶绿素含量最高，显著高于对照组及其他处理组（P＜0.05），100 mg/L 肉碱组中海水小球藻叶绿素含量最低，但与L- 肉碱浓度为200 mg/L 时相比差异不显著（P＞0.05）。原因可能是由于L-肉碱属于季铵盐阳离子复合物，研究表明季铵盐阳离子复合物能够与某些细胞膜蛋白相互作用，改变其通透性，从而提高小球藻对N 等营养素的亲和力（曾惠，2014），促进其对营养元素的吸收。因此，L- 肉碱能够促进海水小球藻叶绿素含量很可能与其属于季铵盐阳离子复合物的属性有关。另外，L- 肉碱的主要功能是参与脂类代谢，为机体供能，同时产生乙酰CoA，乙酰CoA又是藻类色素合成的前提物质，因此肉碱对海水小球藻叶绿素含量的影响也可能与L- 肉碱参与脂类代谢有关。

3.4 不同浓度L- 肉碱对海水小球藻金属元素铁、镁含量的影响

在藻类的生长过程中，镁由镁螯合酶复合物催化Mg2+与原卟啉IX 结合，是叶绿素组成的重要金属元素。铁是叶绿素合成过程中关键酶的重要组成元素，在叶绿素合成过程中具有辅助催化的作用，同时在一定浓度范围内铁对藻类生长具有促进作用（丁飞飞，2010）。已有研究表明，L- 肉碱不仅能够促进小球藻种群增长，还能提高金属元素铁等营养盐的吸收（林伟杰，2017），本试验结果表明不同浓度L- 肉碱对海水小球藻金属元素铁、镁含量均有影响。海水小球藻金属铁、镁含量随着L- 肉碱浓度增高呈现先升高后逐渐降低的趋势。在L- 肉碱浓度为5 mg/L 时肉碱组海水小球藻金属铁、镁含量最高，其中金属铁含量显著高于对照组及其他处理组（P＜0.05），而金属镁含量则显著高于对照组并在一定程度上高于其他处理组；200 mg/L 肉碱组中海水小球藻金属铁、镁含量最低，其中金属铁含量显著低于对照组及其他处理组（P＜0.05），而金属镁含量则在一定程度上低于对照组及其他处理组（P＞0.05）。这表明L- 肉碱的加入能够有效增加海水小球藻中金属元素铁、镁的含量。这应该是由于藻类对铁等营养元素的吸收是通过主动运输，它们需要在藻细胞膜表面转运蛋白的转运作用以及相关酶的辅助下，才能被藻细胞吸收利用（鲍亦璐，2012）。目前已有关于L- 肉碱对动物细胞膜的研究表明，L- 肉碱可以保护细胞膜的完整性，对细胞膜有及时修复的功能，并减少对磷脂双分子层的损害，能够增加细胞膜的稳定性（王朕朕等，2012）。另外，L- 肉碱也可能通过提高藻细胞内脂肪酸β- 氧化，降低其膜脂质降解作用（周涛等，2006）。因此，L- 肉碱很可能是通过提高细胞膜稳定性从而提高海水小球藻对金属元素的吸收。另外，海水小球藻中金属元素铁、镁的含量有随着L- 肉碱浓度增高而降低的趋势，出现这种现象的原因可能是由于水体中的铁盐溶解度小，可利用率低，同时易与磷酸盐生成沉淀。因此形成沉淀物导致海水小球藻中金属元素铁、镁的含量减少。

本试验条件下，5 mg/L 的L-肉碱能显著提高海水小球藻中叶绿素含量及金属元素铁、镁的含量。

参考文献：（略）