针对糖基化进行抗肿瘤药物开发的研究进展

田路路,戴蓓英

(中国药科大学药物科学研究院,江苏 南京 211198)

糖基化是一种与糖链合成和连接有关的酶促反应过程,它由糖基转移酶调控,是各种生物过程的基础。糖基化作为一种常见的蛋白质翻译后修饰方式,对调节细胞功能至关重要。异常的糖基化修饰可加速细胞增殖,减弱细胞与基质间相互作用,促进细胞迁移和分化,并参与调节机体的抗肿瘤免疫反应,最终促进肿瘤发展。鉴于糖基化在肿瘤发生发展中的重要作用,越来越多的研究将糖基化作为研究对象来开发相应的抗肿瘤药物,本文对针对糖基化过程进行抗肿瘤药物开发的研究现状进行了综述和展望。

1 糖基化概述

1.1 糖基化糖基化是由糖基转移酶调控的与糖链合成和连接有关酶促过程[1],是重要的蛋白质翻译后修饰形式之一,异常的糖基化修饰可加速细胞增殖、促进细胞迁移和分化、减弱细胞与基质间相互作用并参与调节机体的抗肿瘤免疫反应,最终促进肿瘤发展[2]。一个细胞或组织中糖基化修饰的完整模式是由许多糖基化修饰酶的同步作用组装而成的,这些糖基化修饰酶包括糖基转移酶和糖苷酶,用来糖化各种不同的糖类,如糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖。特定蛋白质的糖基化程度取决于蛋白质序列中糖基化位点的存在和频率,以及细胞或组织中特定糖基化酶的表达和活性[3]。糖基化是蛋白质翻译后修饰中最复杂的一种,参与许多生理事件,对每一个细胞过程都有巨大的影响。糖基化对细胞内以及细胞和蛋白质之间的识别、信号和相互作用事件是必不可少的,并可以在折叠和定义糖蛋白构象方面发挥重要的结构作用[4-5],并且在细胞黏附、细胞外基质相互作用、对蛋白水解酶和免疫识别的保护以及膜组织的许多特性中也是必不可少的[4]。

1.2 糖基转移酶具有特定糖基结构的糖蛋白的修饰需要糖基转移酶(glycosyltransferase,GTs)发挥作用以依次添加相应的糖基结构形成糖链,因此糖基转移酶是糖基化过程中糖链合成的关键酶之一。每种糖基转移酶都有特定的亚细胞定位,它们都依据着严格的底物专一性和有序性以确保糖链中糖基的固定序列[6]。如果糖基转移酶在细胞内发生定位错误或者其表达出现异常,就会导致细胞生物学功能的失常从而导致许多疾病的发生。糖基转移酶的异常改变与肿瘤发生发展密切相关,糖基转移酶可通过形成异常糖链来调节肿瘤相关信号通路,进而影响肿瘤细胞间或细胞与胞外基质的相互作用,影响肿瘤的发生发展过程甚至是肿瘤患者的预后,而肿瘤细胞的特殊微环境也可以反过来通过表观遗传调控以及相关信号通路来调控相关糖基转移酶的表达或者是亚细胞定位,进而引起糖链结构的变化。

1.3 肿瘤相关糖类抗原肿瘤相关糖类抗原(tumor-associated carbone antigens,TACAs)是一类广受关注的抗肿瘤免疫治疗抗原,与正常细胞相比,多种TACA在癌细胞表面过度表达[7]。TACAs根据非糖部分的不同,可分为两个大类:一是糖蛋白抗原,包括Thomsen-nouveau (Tn)、Thomsen-Friedenreich(TF) 和唾液酸化的Tn (sTn)抗原,这类抗原通过α-linker连接到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基;二是糖脂抗原,它是连接到了神经酰胺脂类的糖类,通过脂质的疏水相互作用锚定在细胞表面的糖类抗原。而糖脂抗原可进一步分为以下几个小类:一是神经节苷脂(ganglioside,GD),如 GD2、GD3、GM2、GM3 和岩藻糖基化的GM1;二是Globo 类,例如 Globo-H、Gb3、Gb4 和 Gb5;三是血型决定素,例如 Lewisx、Lewisy 及其唾液酸化的衍生物等[8]。TACAs可以与原提呈细胞上的糖结合受体结合产生相互作用,进而诱导免疫抑制信号从而促进免疫逃逸[9]。其中几种重要的TACA:神经节苷脂GD2和糖蛋白黏蛋白1(MUC1)是目前肿瘤免疫治疗研究的热点。

2 癌症中的糖基化改变

与致癌转化相关的糖基化变化在70多年前首次被报道[10-11],单克隆抗体技术的出现进一步证实了该观察结果[12]。一般来说,癌细胞发生了与正常糖基化途径不一样的转变,由于一种或多种因素导致细胞的聚糖表达改变。首先,聚糖表达的改变可归因于糖基转移酶的表达不足或过表达[13],第二,聚糖表达的改变可能是由于肽主链和新生聚糖链的三级构象的变化。第三,差异可能源于不同受体底物的可变性,以及糖核苷酸供体和辅因子的可用性和丰度[14]。最后,聚糖表达的变化也与高尔基体中相关糖基转移酶的表达和定位有关[15]。糖蛋白或糖脂的糖基结构的变化通过调节肿瘤细胞周期失调、降解细胞外基质(ECM)和基底膜、促进肿瘤扩散和血管生成以及促进免疫逃逸而参与癌症的进展[16]。最常见的与癌症相关的糖基化改变是唾液酸化、岩藻糖化、O-糖链截短体以及N-糖链的分支增多。

2.1 唾液酸化唾液酸化是细胞糖基化的重要修饰,因为唾液酸化糖类在细胞识别、细胞黏附和细胞信号传递中具有重要作用。糖基转移酶表达改变导致的整体唾液化水平升高与癌症密切相关,特别是α2,6 -和α2,3 -连接唾液化水平升高[17]。

乳氨酸链通常以唾液酸为末端,例如α2,6-唾液酸化乳糖胺(Sia6LacNAc)是β-半乳糖苷α2,6-唾液酸转移酶I(ST6Gal-I)的产物,而ST6Gal-I是一种在包括结肠癌、胃癌和卵巢癌在内的多种恶性肿瘤中表达失调的酶[18],而且已被报道为结肠癌中预后不良的预测标志[19]。

SLea和SLex也是与癌症相关的主要唾液酸化抗原。SLex是选择素的配体,在癌症中,SLex与选择素的相互作用,从而形成癌细胞和血小板的栓塞并有利于它们在内皮细胞上的阻滞来调节转移级联,因此促进癌细胞的黏附和转移[20]。SLea四糖,是一种被广泛应用于临床的癌症相关标志物,是通过血清学检测肿瘤相关糖类抗原CA19-9检测出来。CA19-9检测主要用于已确诊为胰腺癌、结直肠癌、胃癌或胆管癌的患者,主要用于监测对治疗的临床反应[21]。

2.2 岩藻糖基化岩藻糖基化是由一系列岩藻糖基转移酶合成的,岩藻糖基化是一种不可延伸的修饰,通常分为末端岩藻糖基化和核心岩藻糖基化。核心岩藻糖化包括通过α-TVIII(由FUT8编码)将FUC 1,6-岩藻糖加到N-糖链最内侧的GlcNAc残基上,FUT8和核心岩藻糖基化的过度表达是几种癌症的重要特征,比如肺癌和乳腺癌[22-23]。岩藻糖基化的α-甲胎蛋白的是早期检测肝细胞癌(HCC)的公认生物标志物,通过检测该指标可区分肝细胞癌、慢性肝炎和肝硬化[24]。另外还有研究发现,表皮生长因子受体(EGFR)核心岩藻糖基化的增加与二聚化和磷酸化的增加有关,这导致EGFR介导的与肿瘤细胞生长和恶性相关的信号传导增加[22]。

2.3 O-聚糖截短体的产生肿瘤的另一个共同特征是截短的O-聚糖的过度表达,GalNAc型O-聚糖,也称为粘蛋白型O-聚糖,经常在大多数跨膜和分泌型糖蛋白中发现。在恶性肿瘤期间,糖蛋白中也会发生异常的糖基化,这些糖蛋白表现出短链或截短型糖链的异常表达,如二糖汤姆森-弗里登赖希抗原(T抗原,也称为核心蛋白1)和单糖GalNAc(也称为Tn)及其唾液酸化形式(分别为ST和STn),这是O聚糖不完全合成不完全的结果[25]。肿瘤中STN的异常合成是由于ST6GalNAc-I过度表达所致[26],STN被认为是一种重要的预后指标和抗癌疫苗设计的靶点[27]。

2.4 N-聚糖分支的改变在癌变过程中,癌细胞中经常发生的糖基化变化是复杂的β1,6-分支N-连接糖链表达增加[28], GlcNAc-分支N-糖链表达增加是由于GnT-V活性增强。GnT-V是甘露糖乙酰-氨基葡萄糖转移酶5(MGAT5)基因编码的一种酶,肿瘤中异常激活的RAS-RAF-MAPK信号通路调节MGAT5的表达[28]。有研究证实,在永生化的肺上皮细胞系中过表达MGAT5导致细胞失去接触抑制,使细胞运动性增强并增强了裸鼠体内的成瘤能力[29]。

与GnT-V的功能相反,GnT-III(由MGAT3编码)催化β1,4-链上二等分的GlcNAc N-糖链的加成,抑制包括β1,6-分支结构在内的N-糖链的额外加工和延伸。有研究证实,过表达MGAT3能抑制具有高转移潜能的小鼠黑色素瘤B16细胞在小鼠体内的肺转移,说明GnT-III拮抗GnT-V在肿瘤中的作用,抑制肿瘤转移[30]。

3 基于糖基化的抗肿瘤药物开发

肿瘤的发生发展过程中存在各种生物分子上糖基化的特异性,这也说明了以糖基化为靶点治疗肿瘤的可行性和重要性,糖基转移酶抑制剂、基于TACAs的CAR-T细胞、糖基/糖肽疫苗和抗体治疗等基于糖基化的治疗方法已经在研发和应用中。

3.1 基于糖基转移酶的小分子抑制剂糖基转移酶广泛存在于内质网和高尔基体内,参与糖蛋白以及糖脂中聚糖链的生物合成。糖基转移酶在癌细胞中的异常表达对癌细胞的生存、迁移、侵袭等能力都有重要影响。因此,抑制特定糖基转移酶的表达能够阻断特定糖蛋白的合成,进而抑制癌细胞的黏附及迁移能力,可以作为癌症治疗的新途径。

由唾液酸转移酶(STs)催化引起的异常唾液酸化常见于癌细胞中,并且与癌症转移增加有关,但早期开发的唾液酸转移酶抑制剂由于其较差的细胞通透性而不适用于临床使用。2010年一篇文章报道了一种细胞通透性良好的泛唾液酸糖基转移酶抑制剂AL10,AL10可以有效减弱细胞表面的α-2,3-唾液酸化,通过抑制整合素介导的信号传导抑制肺癌细胞的侵袭和转移[31]。2011年该团队的另一篇文章又报道了一种新的泛唾液酸糖基转移酶抑制剂Lith-O-Asp,Lith-O-Asp抑制各种癌细胞系的迁移和侵袭能力,对人脐静脉内皮细胞的血管生成活性具有抑制作用并且降低了整合素-β1的唾液酸修饰,并抑制了磷酸化FAK、磷酸paxillin和基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP9的表达。证明潜在的泛ST抑制剂Lith-O-Asp可能通过抑制FAK/paxillin信号传导和表达抗血管生成因子来抑制癌细胞转移[32]。2021年该团队的一项研究也报道了一种唾液酸糖基转移酶抑制剂-FCW34,FCW34是在Lith-O-Asp基础上优化结构得来的,体内实验结果表明FCW34能够抑制乳腺癌细胞生长,减少血管生成并降低细胞迁移能力,并且作者提出FCW34通过操纵N-聚糖唾液酸化,进而调节talin/integrin/FAK/paxillin and integrin/NF-κB信号通路可能是一种可行的治疗方法[33]。

胰腺癌是一种高度侵袭性的癌症,通常在晚期被诊断,并且在所有恶性肿瘤中预后最差,其特征是致密的结缔组织增生反应和多种黏蛋白的表达改变。此外,黏蛋白与胰腺癌的发展密切相关,已经有研究表明黏蛋白的异常表达和过度表达与胰腺癌的发生进展和不良预后之间存在重要联系[34]。黏蛋白合成的核心酶2-β-1,6-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GCNT3)在黏蛋白生物合成中起重要作用,GCNT3的异常表达导致黏蛋白的过度合成。2016年一篇文章利用分子对接的方法将他尼氟酯确定为一种选择性结合GCNT3的新型抑制剂,无论是单独使用还是与EGFR抑制剂吉非替尼联合使用都对黏蛋白的产生具有抑制作用,并且能够抑制胰腺癌细胞的增殖能力,表明通过抑制GCNT3从而减少黏蛋白生物合成可能会提高药物反应性,值得在胰腺肿瘤发生的临床前模型中进一步开发和研究[35]。

N-糖基化在多种癌症中存在异常表达,并且与癌症的恶性程度相关。研究表明临床批准的药物氟伐他汀可以通过抑制 N-乙酰葡萄糖转移酶从而减少N-糖基化和N-糖链分支来促进肿瘤细胞死亡,并在术后转移性乳腺癌小鼠模型中减少了乳腺癌转移并将小鼠生存期延长了30%以上[36]。

β-1,4-半乳糖基转移酶(β-4GalT)在多种癌细胞中表达增加,对癌细胞的生长、迁移以及侵袭能力都具有促进作用,研究表明8-羟基喹啉(8-HQ)的衍生物对β-4GalTs具有抑制效果,在特定浓度范围内 8-HQ 对癌细胞具有细胞毒性, 是十分具有前景的抗肿瘤制剂[37]。

N-乙酰半乳糖胺基转移酶(ppGalNAc-T)家族中 ppGalNAc-T3对癌细胞的转移具有促进作用,从而使癌症的致死率增加[38]。为了确定一种专门调节ppGalNAc-T3的化合物,Song等[39]对实验室培养的人类细胞进行了改造,使其在ppGalNAc-T3被阻断时发出荧光,在筛选的20 000多种化合物中,一种称为T3Inh-1的化合物能够选择性阻断ppGalNAc-T3。T3Inh-1 是一种特异性的ppGalNAc-T3 抑制剂,研究表明 T3Inh-1 在体外实验中抑制了乳腺癌细胞的迁移,在体外实验以及体内小鼠生长的组织细胞中都降低了 FGF23 激素水平,并且不会引起任何毒副作用。

虽然针对糖基转移酶已有多种小分子抑制剂在研发当中,但由于糖链的多变性和动态性以及供体和受体底物的多样性,糖基转移酶是一个具有挑战性的靶标类别。糖基转移酶也是高度分支的多基因家族,其数量非常庞大、底物也很灵活,因此了解每种糖基转移酶具体的结构和生物功能可以为针对糖基转移酶开发药物的研究提供思路。

3.2 基于TACAs的CAR-T疗法CAR-T细胞的过继性回输以非MHC依赖的方式治疗癌症,是一种有前途的免疫疗法策略,但迄今为止在实体瘤治疗中展现的效果不佳,主要原因包括CAR-T细胞增殖能力有限、CAR-T细胞难以向肿瘤组织转运以及实体瘤中抑制T细胞增殖和细胞因子产生的复杂肿瘤微环境[40]。

GD2是一种含有糖脂抗原并且由5种单糖组成的N-乙酰神经氨酸,它通过神经酰胺脂质锚定在质膜的脂质双层上。正常组织中GD2的表达水平较低[41],但在神经母细胞瘤、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤和肉瘤等各种类型的癌症中表达水平很高[42]。正是因为GD2在实体瘤中的重要性和靶向性,抗GD2 的CAR-T细胞免疫治疗在各种类型的肿瘤中得到了广泛的研究,已有好几项临床试验包括NCT02761915、NCT03373097、NCT03721068、NCT03635632、NCT01822652和NCT01953900都被批准用于评估GD2-CAR-T细胞在神经母细胞瘤中的作用[43]。

人类黏蛋白1(MUC1)是一种高分子量糖蛋白,通常在各种组织的上皮细胞层上表达以保护暴露在外部环境中的这些上皮细胞。MUC1-N和MUC1-C这两个亚基在细胞表面形成稳定的非共价复合体,亚基之一MUC1-N含有可变数量的20个氨基酸串联重复序列(VNTR)。正常细胞中MUC1-N的每个VNTR的丝氨酸或苏氨酸残基都被高度糖基化,而肿瘤细胞上的MUC1则被更短的糖链所修饰以暴露出蛋白质骨架[44]。由于Tn(GalNAc α1-O-Ser/Thr)是癌症组织中最常见的异常糖类,因此MUC1的Tn糖类(Tn-MUC1)是CAR治疗的一个有希望的靶点。美国宾夕法尼亚大学Posey等[45]发现Tn-MUC1 CAR-T显示出针对T细胞淋巴瘤和胰腺肿瘤的抗肿瘤效力,证实了靶向异常糖基化 MUC1 分子的 CAR-T 技术是可能打破实体瘤免疫耐受的新方法。由Tmunity Therapeutics开发的Tn-MUC1-CAR是领先的MUC1-CAR-T细胞疗法,目前正在进行Ⅰ期临床试验(NCT04025216)。

3.3 基于TACAs的抗肿瘤疫苗抗肿瘤疫苗可以为机体提供长期的保护,其成功开发将是癌症防治领域的巨大飞跃,而抗肿瘤疫苗设计的首要任务是抗原的合理设计,TACAs被认为是设计抗肿瘤疫苗的有前途的靶点,但糖类本身只能引起较差的免疫原性,因为它们无法诱导T细胞依赖的免疫反应,而T细胞依赖的免疫反应对癌症治疗至关重要。此外,由于天然TACA的内源性性质,使用其作为抗原很容易诱导免疫耐受和免疫抑制。克服这些障碍的最新策略主要包括:①将TACAs共价偶联到合适的载体上以提高免疫原性,包括簇状或多价结合疫苗;②将TACAs与T细胞表位或内置佐剂偶联以形成多组分糖结合疫苗;③开发基于化学修饰的TACAs结合癌细胞代谢工程的疫苗[8]。

有研究报道了一种含有GD2和GD3的二价疫苗,它以OPT-821为佐剂,已经在高危神经母细胞瘤患者中进行了Ⅰ期试验[46]和Ⅱ期试验(NCT00911560)[47]。其Ⅰ期试验结果发现在15名患者中有12名观察到了明显的反应,并且在10名患者中有6名患者表现出微小残留病灶(MRD)的消失[46]。Ⅱ期试验结果也显示了强大的抗体反应,并且将更高的抗GD2-IgG1滴度与更高的存活率成功关联[47]。

3.4 基于TACAs的抗体几种抗GD2单克隆抗体已在临床实验中取得成功,甚至获批投入临床治疗市场。Dinutuximab是一种靶向GD2的单克隆抗体,Dinutuximab与GD2结合,通过从外周血单核细胞群中招募粒细胞和自然杀伤细胞,诱导ADCC、CDC导致神经母细胞瘤细胞的死亡[48]。该抗体于2015年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-2 (IL-2)和13-顺式视黄酸(RA)联合治疗儿童高危神经母细胞瘤[49]。最近,FDA加速批准了人源单抗Hu3F8 (Naxitamab,Danyelza©)联合GM-CSF治疗复发或难治性骨或骨髓高危成神经细胞瘤,主要是因为这种治疗方式的两项临床试验(NCT03363373和NCT01757626)有着惊人的总体缓解率和反应持续时间。

一些靶向GD2和其他免疫细胞受体(例如CD3、CD64等)的双特异性抗体(BsAbs)在抗癌治疗中也有很大的前景,这种策略使免疫细胞与肿瘤细胞接近,并通过穿孔素/颗粒酶介导的、非MHC限制的、特异性的抗肿瘤细胞毒性来杀死肿瘤细胞。一项Ⅰ/Ⅱ期试验正在评估hu3F8-CD3双特异性抗体在复发难治性神经母细胞瘤、骨肉瘤和其他表达GD2的实体肿瘤患者中的毒性、药代动力学和抗肿瘤活性(NCT03860207),也有另一项多中心临床试验正在评估该双特异性抗体在小细胞肺癌(SCLC)中的抗肿瘤作用(NCT04750239)。

2012年,古巴一团队在研发非小细胞肺癌抗独特型抗体-Varira(Racotumomab)这项研究上取得了胜利,他们的第一步是用含有GM3的脂质体(Neu5Gc)免疫小鼠,结果产生了识别表达GM3(Neu5Gc)的不同癌症的单抗P3(IgM),随后用与载体蛋白KLH偶联的单克隆抗体P3免疫小鼠,从而获得了抗独特型单克隆抗体1E10 (IgG)[50]。Racotumomab在诊断为表达N-糖基化神经节苷脂并且对常规治疗耐药的儿童癌症患者中进行了Ⅰ期临床试验,大多数患者产生了免疫反应[51]。目前,针对高危神经母细胞瘤患者的Ⅱ期试验正在进行中(NCT02998983),另外有也有两项临床试验评估了该单抗在晚期肺癌中的应用(NCT01240447和NCT01460472)。Vaxira©已在阿根廷和古巴上市,被批准作为晚期非小细胞肺癌(NSCLC)治疗的主动免疫治疗剂的抗独特型抗体。

4 展望

总之,目前针对糖基化进行的抗肿瘤药物研发的研究是非常有探索价值的,但因糖链结构的复杂多样、糖链合成过程的动态化且结构与功能之间没有一一对应的线性关系等原因导致目前的研究依然具有一定局限性。未来我们可以充分利用基因工程、蛋白质工程领域的新方法以及糖组学和糖蛋白组学的生物数据库,克服目前研究出现的困难,开发新的肿瘤特异性糖链抗原。针对肿瘤糖基化的药物开发可能会克服目前在癌症患者的诊断、预后和治疗方面的许多限制,可协同当前的肿瘤治疗提高特异性和有效性,为肿瘤患者的个性化治疗和综合治疗提供新的策略和思路。