miR-381在HCC患者肿瘤组织、外周血中表达及过表达对巨噬细胞极化模式调节作用

吴书志，王菁

1 山东省疾病预防控制中心，济南 250013；2 山东第一医科大学附属中心医院医学实验诊断中心

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌类型，是所有癌症中第六大常见的癌症类型和第二大死亡原因［1］。HCC 发生及发展的机制极其复杂，其中一个重要的因素是细胞免疫功能紊乱［2］。多项研究［3-4］表明，肝内免疫抑制状态微环境是HCC 患者的特征性表现。研究［5］显示，肿瘤组织中浸润的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages，TAMs），与HCC 进展和预后有关。巨噬细胞具有很高的可塑性，不同的病原体或刺激因素时其表型发生不同的分化，以增强应对微环境变化的能力，这个过程即为巨噬细胞的极化。根据极化后巨噬细胞的表面标志物及其功能，将其分为M1 型（经典活化，免疫活化）巨噬细胞和M2 型（替代激活，免疫抑制）巨噬细胞。TAMs是癌症和免疫微环境之间相互作用的关键调控因子［6］。在大多数实体肿瘤中，TAMs 以M2 型巨噬细胞为主，M2 型巨噬细胞具有促进肿瘤的作用。TAMs 可以通过淋巴系统或通过肿瘤内毛细血管屏障进入外周循环，成为循环单核细胞［7］。研究［7-9］表明，外周血中的M2 型单核细胞可能是实体肿瘤的潜在生物学标志物。然而，关于HCC 患者外周血单核细胞极化的研究较少。miRNA 是一组含有20 至22个核苷酸的非编码RNA 分子，被发现参与多种生理和病理过程［10-11］，如细胞分化、侵袭和肿瘤发生［12-14］。。miR-381 在消化系统相关的多种癌症中表达下调，包括口腔鳞状细胞癌（OSCC）、胃癌和HCC［15-16］。虽然关于肝癌患者miR-381 与单核-巨噬细胞极化之间关系的研究较少，但已有报道称miRNA 可以调节肿瘤组织中浸润的巨噬细胞参与肿瘤的发展，与恶性肿瘤中巨噬细胞的M2 极化有关［17-18］。现有的巨噬细胞极化检测方法主要包括基于表型和基因表达的方法。M1 型巨噬细胞表面通常表达CD86 和CD16 等标记物，而M2 型巨噬细胞表面通常表达CD206 和CD163 等标记物。基于基因表达的方法则通过检测巨噬细胞特定基因的表达水平来判断巨噬细胞的极化状态，例如M1 型巨噬细胞通常表达白介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和一氧化氮合酶（iNOS）等炎症相关基因，而M2 型巨噬细胞通常表达白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）和精氨酸酶1（Arg-1）等抗炎相关基因。2022年3月—2023年3月，我们观察了miR-381 在HCC 患者肿瘤组织、外周血和体外诱导分化巨噬细胞中的表达变化，并探讨miR-381 过表达对巨噬细胞极化模式的调节作用，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取济南市中心医院2022年3月—2023年3月诊治的HCC 患者40 例，男性28 例、女性12 例，年龄46.2（35～67）岁。纳入标准：①术后经病理学诊断为原发性HCC；②在手术切除以及抽血之前，患者未接受放疗、化疗、中药、免疫或靶向治疗；③未合并其他部位的恶性肿瘤、血液系统和免疫系统疾病。同期选取健康志愿者40 例，男性26 例、女性14例，年龄43.4（34～61）岁。患者及其家属均同意并签署知情同意书，所有涉及患者标本的实验均经我院伦理委员会批准（批准文号SZR2022-023-01）。

1.2 HCC 患者肿瘤组织与癌旁组织中miR-381、巨噬细胞标记物iNOS 和Arg-1 表达观察 40 例HCC患者均接受手术切除肿瘤治疗，术中留取肿瘤组织与癌旁组织（距肿瘤组织边缘≥2 cm）。

1.2.1 HCC 患者肿瘤组织与癌旁组织中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA 检测 采用RT-PCR 法。TRIzol 法提取标本中的总RNA，取总RNA 1 μg 进行逆转录反应，模板cDNA 于-20℃冰箱保存。RT-PCR 扩增所需引物的序列如下：miR-381正向引物为5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，反向引物为5′-CACTTCCTCAGCACTTGTTGGTAT-3′；iNOS 正向引物为5′-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3′，反向引物为5′-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3′；Arg-1 正向引物为5′-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3′，反向引物为5′-AGGAGCTATCATTAGGGACATC-3′；GAPDH 正向引物为5′-ACCACAGTCCATGCCAC-3′，反向引物为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；U6 正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；qRT-PCR 反应条件为：25 μL体系，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，71 ℃延伸1 min，35 个循环，71 ℃最后延伸2 min。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.2.2 HCC 患者肿瘤组织与癌旁组织中iNOS、Arg-1 蛋白检测 采用Western Blotting 法。按照蛋白裂解液说明书对组织/细胞总蛋白进行提取，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品浓度后，加SDS-PAGE 上样缓冲液煮沸5 min。取20 μg 蛋白质上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，冰浴条件下100 V 恒压转膜2 h，将蛋白转移到0.45 μm 聚偏二聚甲醛（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，PVDF 膜与特异性一抗（iNOS、Arg-1）在4 ℃下孵育过夜。次日，将膜与二抗在室温下孵育1 h。将膜置于ECL 发光液中反应，于凝胶成像系统中曝光并采集图像，采用Image lab 3.0 软件分别获取蛋白质信号条带图像进行信号分析，以蛋白条带灰度值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 HCC 患者与健康志愿者外周血巨噬细胞中miR-381、巨噬细胞标记物CD86 和CD163 表达观察 分别抽取患者手术前静脉血20 mL 以及健康志愿者静脉血20 mL，采用Ficoll 密度梯度分离法分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），采用流式细胞术检测单核细胞纯度＞95%即为合格。

1.3.1 HCC 患者与健康志愿者外周血巨噬细胞中miR-381 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 检测 检测方法参照“1.2.1”，其中CD86 正向引物为5′-CTGCTCATCTATACACGGTTACC-3′，反向引物为5′-GGAAACGTCGTACAGTTCTGTG-3′；CD163正向引物为5′-CGGTCTCTGTGATTTGTAACCAG-3′，反向引物为5′-TACTATGCTTTCCCCATCCATC-3′。

1.3.2 HCC 患者与健康志愿者外周血巨噬细胞中CD86、CD163 蛋白检测 采用流式细胞法。细胞用荧光色素标记的单克隆抗体染色：FITC-anti-CD14检验单核细胞的纯度，FITC-anti-CD86 作为M1 型单核细胞的标记，APC-anti-CD163作为M2型单核细胞的标记。标记15 min 后，PBS 清洗细胞，并在PBS 中悬浮，使用FacsCantoII 流式细胞仪进行分析，记录每个样本至少5000个细胞，使用FacsDiva软件分析数据，以CD86 + 、CD163 + 细胞所占的比例分别代表CD86、CD163蛋白的水平。。

1.4 体外诱导分化的巨噬细胞中miR-381、iNOS、Arg-1、CD86、CD163表达观察

1.4.1 巨噬细胞的体外诱导分化及分组 人高转移性肝癌细胞系LM3和人髓系白血病单核细胞（human myeloid leukemia mononuclear cells，THP-1）购自中国科学院细胞资源中心，在37 ℃、5%CO2培养箱中用RPMI 1640 培养基添加10%胎牛血清和1%青霉素链霉素进行培养。取1×106个THP-1 细胞在6孔板中培养，加入100 ng/mL的PMA孵育6 h诱导细胞分化，THP-1 细胞被诱导贴壁成为M0 型巨噬细胞，记为M0组。取M0型巨噬细胞，10 ng/mL的IL-4孵育48 h，诱导成为M2 型巨噬细胞，记为为M2 组。取1×106个LM3细胞在6孔板中培养过夜，次日将每孔的培养基改为无血清培养基，24 h 后收集条件培养基（Conditioned medium，CM），培养M0 型巨噬细胞，模拟TAMs，记为CM组。

1.4.2 各组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA检测 检测方法参照“1.2.1”。

1.4.3 各组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白检测 检测方法参照“1.2.2”、“1.3.2”。

1.5 过表达miR-381 对体外诱导分化巨噬细胞极化模式的调节作用观察

1.5.1 巨噬细胞转染及分组 将THP-1 细胞接种于6 孔板中，并诱导成为M0 型巨噬细胞，当达到80%融合时，分别用Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂将miR-381 模拟物（miR-381 mimic）、对照模拟物（mimic NC）转入M0型巨噬细胞，记为miR-381 mimic组、mimic NC组。

1.5.2 两组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA检测 检测方法参照“1.2.1”。

1.5.3 两组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白检测 检测方法参照“1.2.2”、“1.3.2”。

1.6 统计学方法 采用Graph Pad Prism 8.0 统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC患者肿瘤组织与癌旁组织中miR-381、iNOS、Arg-1表达比较

2.1.1 HCC 患者肿瘤组织与癌旁组织中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA 相对表达量比较 HCC 患者肿瘤组织中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA 相对表达量分别为0.453±0.071、0.514± 0.089、1.749± 0.121，HCC 患者癌旁组织中miR-381mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA相对表达量分别为1.063± 0.136、0.994± 0.099、1.041± 0.103，两组相比，P均＜0.05。

2.1.2 HCC 患者肿瘤组织与癌旁组织中iNOS、Arg-1 蛋白相对表达量比较 HCC 患者肿瘤组织中iNOS、Arg-1 蛋白相对表达量分别为0.435± 0.053、1.581± 0.101，HCC 患者癌旁组织中iNOS、Arg-1 蛋白相对表达量分别为1.499± 0.119、0.547±0.046，两组相比，P均＜0.05。以上结果说明，在HCC 患者肿瘤组织中miR-381 呈低表达，巨噬细胞以M2型极化为主。

2.2 HCC 患者与健康志愿者外周血巨噬细胞中miR-381、CD86、CD163表达比较

2.2.1 HCC 患者与健康志愿者外周血巨噬细胞中miR-381 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相对表达量比较 HCC 患者外周血巨噬细胞中miR-381 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相对表达量分别为0.692± 0.041、0.613± 0.068、1.612±0.109，健康志愿者外周血中巨噬细胞中miR-381 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相对表达量分别为1.453± 0.120、1.054± 0.119、0.996±0.095，两组相比，P均＜0.05。

2.2.2 HCC 患者与健康志愿者外周血巨噬细胞中CD86、CD163 蛋白表达水平比较 HCC 患者外周血巨噬细胞中CD86、CD163 蛋白表达水平分别为28.14%± 3.32%、56.41%± 5.31%，健康志愿者外周血巨噬中细胞的CD86、CD163蛋白表达水平分别为44.13%± 4.34%、39.52%± 4.16%，两组相比，P均＜0.05。以上结果提示，HCC患者外周血巨噬细胞中miR-381呈低表达，巨噬细胞以M2型极化为主。

2.3 各组巨噬细胞中miR-381、iNOS、Arg-1、CD86、CD163表达比较

2.3.1 各组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相对表达量比较 各组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相对表达量比较见表1。由表1 可知，CM 组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相对表达量介于M0组、M2组之间（P均＜0.05）。

表1 各组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相对表达量比较（±s）

表1 各组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与M0组相比，*P＜0.05；与M2组相比，#P＜0.05。

组别M0组M2组CM组CD163 mRNA 1.138± 0.1232.271± 0.234*1.411± 0.131*#miR-381 mRNA 1.036± 0.0930.315± 0.039*0.632± 0.056*#iNOS mRNA 0.949± 0.1010.486± 0.049*0.761± 0.068*#Arg-1 mRNA 0.976± 0.0912.481± 0.242*1.586± 0.139*#CD86 mRNA 1.064± 0.1030.356± 0.032*0.684± 0.061*#

2.3.2 各组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表达水平比较 各组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163 蛋白表达水平比较见表2。由表2 可知，CM 组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163 蛋白表达水平介于M0 组、M2 组之间（P均＜0.05）。以上结果说明体外模拟的TAMs中miR-381呈低表达，其极化模式趋向于M2型巨噬细胞。

表2 各组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表达水平比较（±s）

注：与M0组相比，*P＜0.05；与M2组相比，#P＜0.05。

组别M0组M2组CM组CD163蛋白49.36%± 4.68%87.83%± 8.84%*65.62%± 6.47%*#iNOS蛋白1.316± 0.1130.528± 0.511*0.946± 0.107*#Arg-1蛋白0.752± 0.0691.985± 0.206*1.529± 0.148*#CD86蛋白56.23%± 5.32%19.83%± 2.02%*39.36%± 3.18%*#

2.4 过表达miR-381 对体外培养巨噬细胞极化模式的调节作用

2.4.1 两组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相对表达量比较 两组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相对表达量比较见表3。由表3 可知，miR-381 mimic 组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、CD86 mRNA 相对表达量均升高，而Arg-1 mRNA、CD163 mRNA 相对表达量均降低（P均＜0.05）。

表3 两组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相对表达量比较（±s）

表3 两组巨噬细胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与mimic NC组相比，*P＜0.05。

组别mimic NC组miR-381 mimic组CD163 mRNA 0.981± 0.0900.328± 0.028*miR-381mRNA 1.145± 0.09810.254± 1.095*iNOS mRNA 1.083± 0.0892.419± 0.216*Arg-1 mRNA 1.170± 0.1370.519± 0.047*CD86 mRNA 0.970± 0.0912.695± 0.231*

2.4.2 两组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表达水平比较 两组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163 蛋白表达水平比较见表4。由表4可知，miR-381 mimic 组巨噬细胞中iNOS、CD86 蛋白表达水平均升高，而Arg-1、CD163 蛋白表达水平均降低（P均＜0.05）。以上结果提示，过表达miR-381 后，M1 的指标CD86、iNOS 表达有所提高，M2 的指标CD163、Arg-1 表达有所下降，说明过表达miR-381 可以诱导巨噬细胞向M1 型极化转变。

表4 两组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表达水平比较（±s）

表4 两组巨噬细胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表达水平比较（±s）

注：与mimic NC组相比，*P＜0.05。

组别mimic NC组miR-381 mimic组CD163蛋白50.28%± 4.87%27.43%± 2.54%*iNOS蛋白0.962± 0.0881.852± 0.091*Arg-1蛋白1.130± 0.1480.627± 0.059*CD86蛋白51.38%± 5.07%74.18%± 7.26%

3 讨论

HCC 是一种在世界范围内发病率高的恶性肿瘤，病程短，早期临床症状不典型，死亡率高［19］。肿瘤的发生过程中会出现免疫系统的功能异常。细胞免疫功能的降低可导致免疫细胞对肝癌细胞的识别及吞噬能力降低，使肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视及攻击，从而肝癌细胞能够生长繁殖。因此，通过调节肝癌患者的细胞免疫水平治疗肝癌是一种新的途径［20］。

TAMs 在包括HCC 在内的炎症相关癌症的进展中发挥着关键作用。TAMs 中，巨噬细胞占较大比例。M1型巨噬细胞具有较强吞噬、促炎及抗肿瘤活性，M2 型巨噬细胞有抑制炎症、促肿瘤的活性。近年来，意识到TAMs 在肝癌的进程中起着推波助澜的作用，所以开展了很多关于促进M2 型巨噬细胞向M1 型复极化的相关研究。MAO 等［21］研究显示，甘草酸可以上调CCR7表达，促进TNF-ɑ、IL-12、IL-6的产生（M1 型巨噬细胞标志物），并且下调MR、Ym1、Arg-1 表达（M2 型巨噬细胞标志物），该效应主要依赖于JNK 和NF-κB 通路的激活。同时，WU等［22］研究证明，2-脱氧葡萄糖联合放疗可以促进体内巨噬细胞向M1 型极化，阻止向M2 型极化，从而防止肝硬化的进程。复极化的TAMs 可以抑制肿瘤生长，M2型巨噬细胞向M1型转化后有抗肿瘤效应。M1和M2型巨噬细胞在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用，促进M2 型巨噬细胞向M1 型复极化为肝癌的治疗提供了新的思路。

miR-381 是一种新发现的免疫相关miRNA［23］，已成为癌症相关miRNA 的研究热点。最近有研究［24］表明，miR-381 在肝癌组织中低表达，可抑制细胞增殖和侵袭。然而，关于miR-381 与HCC 患者肿瘤组织巨噬细胞和外周血巨噬细胞细胞极化之间的关系的研究较少。本研究表明，miR-381 在HCC 患者肿瘤组织、外周血巨噬细胞和模拟TAMs 中表达均较低；HCC 患者肿瘤组织中TAMs 主要以M2 巨噬细胞为主；外周血中M2 型巨噬细胞的比例增加；在体外，模拟TAMs 仍表现出M2 极化的特征。因此，我们推测，miR-381 与巨噬细胞的极化有一定的关系。HCC 患者外周血中M2 型巨噬细胞的比例可能作为一种新的生物标志物。因此，有必要对其临床资料进行进一步的研究。在本研究中，通过构建过表达miR-381的细胞模型，我们分析了miR-381与巨噬细胞极化之间的关系。结果表明，过表达miR-381 可诱导M1 极化、抑制M2 巨噬细胞标志物的表达。

综上所述，我们的研究结果揭示了巨噬细胞极化的潜在机制，HCC 患者肿瘤组织、外周血巨噬细胞、体外模拟TAMs 都倾向于M2 极化，miR-381 低表达；过表达miR-381 可以使巨噬细胞更倾向于M1 极化。我们推测miR-381 与HCC 患者体内的巨噬细胞的极化有一定的关系，可诱导其向M1 型极化，有肿瘤抑制作用。巨噬细胞极化的调控非常复杂，涉及到多个诱导因子和信号通路。国内外的报道中，miRNA 可以通过靶向基因和信号通路来调节巨噬细胞的极化。因此，在未来的研究中，我们将进一步探索miR-381 调控巨噬细胞极化的靶基因和通路，寻找促进M2 向M1 极化的新靶点和思路。