喉癌治疗后复发的影响因素分析及预测模型构建

郭珊珊，杨文婧，许丽萍，陶倩，王欢，王书谦

沧州市人民医院耳鼻喉科，河北 沧州 061000

喉癌（Laryngeal cancer， LC）属于头颈部肿瘤中相对常见的一类，虽然目前针对早期LC的手术及放化疗方案对于延长患者预后具有不错的临床疗效，但局部中晚期或发生转移的LC患者治疗及预后效果仍不理想［1-2］。近年来伴随着靶向治疗及精准放疗等治疗方案的逐步完善，早期针对可能复发的LC患者开展上述治疗能有效的延长患者无病生存时间，降低疾病复发及转移的可能性，故针对患者预后的研究一直以来是LC临床研究的热点话题［3］。既往的临床研究［4］中，针对LC患者临床资料、实验室及影像学检查资料构建的预后预测分析模型较多，但是由于各地环境、民族及生活习惯的影响，导致此类研究结果可重复性欠佳。近几年由于宏基因组学的发展，国内外开展的单个基因与LC患者预后的相关性分析较多，也充分揭示了人体特殊基因的激活以及表达水平与LC具有较高的相关性，且在同一人种中可重复性较好，这为构建LC预后模型提供了较为准确及便捷的途径［5］。我们在既往LC 宏基因组学研究［6］的基础上，选取细胞骨架蛋白4（cytoskeletal protein 4，CKAP4）、N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（polypeptide Nacetyl galactosamine transferase 2，pp-GalNAc-T2）、跨膜蛋白2（transmembrane protein2，TMEM2）等三个与LC预后相关度较高的基因，并结合患者的基本资料，分析LC 治疗后复发的影响因素，并构建LC治疗后复发的预测模型，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年1月—2017年12月期间于沧州市人民医院确诊的LC 患者80 例，年龄（63.74± 9.87）岁，男性69 例、女性11 例。所有患者根据文献［7］当中的推荐治疗方案，按照患者肿瘤分期予以手术切除、放化疗及靶向治疗等方案进行处理，并将治疗方式纳入临床资料中在预后分析内进行对比。患者完成全部疗程后进行随访，分别于治疗后第1～2年内每2～4 个月、治疗后第3～5年内每3～6 个月，治疗后5年以上每12 个月到院复查。项目包括：①体格检查；②病灶部位内镜检查；③病灶部位影像学检查；④放疗患者甲状腺功能检查。随访截止日期为2022年6月31日。随访终点定义为复发，复发标准根据中华临床肿瘤学会颁布的《头颈部肿瘤诊疗指南2018》中相关推荐，由随访期间患者内镜及影像学检查结果综合评定，评定由3 名副主任以上职称的医师共同评定。统计到随访结束时所有患者LC 复发及未复发等情况，并按照复发情况将所有患者分为复发组17 例、未复发组63 例［8］。纳入标准：①符合NCCN 在2007 颁布的头颈癌诊疗指南［7］；②年龄在18 周岁以上；③病史及随访资料完全；④患者或家属知情同意。排除标准：①合并有其他恶性肿瘤疾病；②收集血液标本前1月内有严重感染、外伤及手术病史；③收集标本前1年内进行过抗肿瘤、免疫抑制剂治疗；④合并严重的肝肾功能障碍；⑤血液标本保存过程不规范。

1.2 两组患者基本资料收集及血清CKAP4、pp-GalNAc-T2、TMEM2 mRNA 检测 ①收集患者的年龄、性别、体质量指数（BMI）、吸烟史、饮酒史、LC 家族史、基础疾病、肿瘤分期、肿瘤位置、肿瘤病理分型、肿瘤直径、肿瘤浸润深度、治疗方案等基本资料。②采用qRT-PCR 法检测血清CKAP4、pp-Gal-NAc-T2、TMEM2 mRNA。首次建档时抽取患者空腹状态下外周静脉血5 mL，在3000 r/min 下离心15 min 并收集上清液，采用TRIzol 法提取总RNA 进行逆转录，取cDNA 作为荧光定量模板进行PCR 反应，95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、44 s，总共进行40 个循环，以GAPDH 为对照。引物序列如下：CKAP4 正向引物为5′-CAGCCGGATCAGCGAAGT-3′，反向引物为5′-TGTGAAGATGGCGATGTTGT-3′；pp-Gal-NAc-T2 正向引物为 5′-AAGGAGAAGTCGGTGAAGCA-3′，反向引物为5′-TTGAGCGTGAACTTCCACTG-3′；TMEM2 正向引物为5′-GGAGATATGCTCCGTCTGACC-3′，反向引物为5′-CATCTGACTTGCCATACAAGGT-3′；GAPDH 正向引物为5′-CTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向引物为5′-GAACGCTTCACGAATTTGC-3′。以2-ΔΔCt表示血清目的基因mRNA的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，比较用独立样本t检验；计量资料呈非正态分布时以中位数［M（P25，P75）］表示，比较用采用Mann-Whitney U 检验；计数资料比较用χ2检验。采用COX 回归分析法分析LC 患者治疗后复发的影响因素，采用Logistic 回归分析法构建LC 治疗后复发的预测模型，采用受试者工作特征曲线（ROC）评估预测模型对LC 治疗后复发的预测价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LC 治疗后复发的影响因素 复发组年龄（64.83± 13.72）岁，男性14 例、女性3 例，高血压6例，糖尿病3 例，吸烟史12 例，饮酒史3 例，LC 家族史3 例，治疗方案中采用放疗14 例、化疗5 例，肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期6 例、Ⅲ～Ⅳ期11 例，病理分型鳞癌16 例、其他类型1 例，肿瘤位置声门上8 例、声门4例、声门下5例，肿瘤分化程度低分化7例、中高分化10 例，血清CKAP4 mRNA 相对表达量6.74± 1.47，血清pp-GalNAc-T2 mRNA 相对表达量13.24±3.12，血清TMEM2 mRNA 相对表达量1.98± 0.47，肿瘤直径（20.37± 9.12）mm，浸润深度（2.04±0.43）mm；未复发组年龄（63.01± 9.56）岁，男性55例、女性8 例，高血压20 例，糖尿病12 例，吸烟史53例，饮酒史13 例，LC 家族史15 例，治疗方案中采用放疗58 例、化疗21 例，肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期44 例、Ⅲ～Ⅳ期19例，病理分型鳞癌60例、其他类型3例，肿瘤位置声门上27 例、声门15 例、声门下21 例，肿瘤分化程度低分化12 例、中高分化51 例，血清CKAP4 mRNA 相对表达量5.75± 1.09，血清pp-Gal-NAc-T2 mRNA 相对表达量11.18± 2.67，血清TMEM2 mRNA 相对表达量1.69± 0.35，肿瘤直径（19.04± 8.59）mm，浸润深度（1.95± 0.32）mm；其中复发组患者肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期占比、血清CKAP4 mRNA 相对表达量、血清pp-GalNAc-T2 mRNA相对表达量、血清TMEM2 mRNA相对表达量均显著高于未复发组（P均＜0.05）。

建立COX 回归分析模型，以是否复发作为因变量，将单因素分析中差异有统计学意义的指标作为自变量，以无病生存时间作为时间变量，结果显示血清CKAP4 mRNA 相对表达量、血清pp-GalNAc-T2 mRNA 相对表达量、血清TMEM2 mRNA 相对表达量是LC 患者治疗后复发的影响因素（P均＜0.05），见表1。

表1 LC患者治疗后复发的影响因素COX回归分析结果

2.2 LC 治疗后复发的预测模型构建及评估结果采用Logistic 回归分析法按照预测概率=常量 + 系数×指标的方法，构建了LC治疗后复发的预测模型，预测概率=-8.967 + 0.724×血清CKAP4 mRNA相对表达量 + 0.081×血清pp-GalNAc-T2 mRNA 相对表达量 + 1.132×血清TMEM2 mRNA 相对表达量。预测模型的ROC 结果显示，该模型对于LC 治疗后复发具有较高的预测价值（AUC=0.872，95%CI=0.779～0.962，Cut off 值≥0.229，P＜0.001），该模型预测LC 治疗后复发的灵敏度为88.23%、特异度为79.36%、阴性预测值为96.13%、阳性预测值为53.57%，见图1。

图1 LC治疗后复发预测模型的ROC

3 讨论

大多数LC起源于喉部深处，在病灶未显著增大且影响吞咽的情况下很少有患者会被提前发现。因此，大约50%的病例被诊断出患有晚期疾病并在5年内死于疾病［9］。当早期对患者进行全面评估同时针对性予以治疗方案后，患者5年生存率提高到80%。近年来，伴随着人类基因研究的逐渐深入，采用基因模型对疾病进行预后预测的效能相较于传统的模型效果较好，且实验可重复性较好，故目前将之运用于临床研究具有一定的可行性［10］。

在本研究中，患者总复发率为21.25%，而根据既往国内外研究调查结果，LC 复发率在16%～40%，本次研究结果与之一致［11］。需要特别指出的是当前的研究中指出，靶向治疗对于中、晚期LC 患者预后具有较好的作用，但本研究中靶向治疗率仅为15.8%，相较于相关研究占比相对较低，主要是由于本研究纳入患者时间跨度相对较长，前期患者可能由于研究、药品等限制，导致无法有效开展靶向治疗［12-13］。在基本资料的比较结果中，两组患者肿瘤分期存在显著差异。肿瘤分期是患者肿瘤大小、病灶侵袭程度、转移范围等相关情况综合分析后得到的综合情况，在所有肿瘤疾病中，肿瘤分期较晚患者相较于早期患者预后较差是必然，这一结果在多个研究中均得到了证实［14-15］。

在SHINNO 等［16-17］研究中指出，CKAP4 过表达与食管癌、透明细胞肾细胞癌等多种癌症的复发相关，其中CKAP4 可以通过KK1/DKK3-CKAP4 信号轴影响PI3K/AKT 通路激活，促进食管鳞状癌细胞的增殖，而PI3K/AKT 通路对于LC 的分化增殖也具有关键性作用，故有研究提出抗CKAP4 抗体可能是一种新的肿瘤靶向治疗药物［18］。由以上叙述不难看出，罹患有LC 患者如果合并有CKAP4 高表达，必然会造成PI3K/AKT 通路过度激活，从而导致患者肿瘤复发，甚至发生其他肿瘤疾病，故CKAP4 与LC 直接存在有显著的相关性。FERNANDES 等［19］的研究中指出，Ras-Raf-MEK-ERK 通路可以通过激活下游标志物EGFR，从而成为头颈部鳞癌发生的重要途径，而高表达的pp-GalNAc-T2 进一步增强Ras-Raf-MEK-ERK 的通路，从而导致EGFR 大量释放入靶细胞内，从而导致LC 细胞侵袭扩散。同时，还有研究指出，pp-GalNAc-T2 可通过调控作用来增强EGFR糖基化和活性，从而促进口腔鳞状细胞癌的迁移和侵袭，故pp-GalNAc-T2 高表达会诱发LC 患者病灶复发、扩散等，导致预后变差。而本研究中复发患者pp-GalNAc-T2 相对表达量高于未复发患者，与之前所述的研究结果类似［20］。TMEM2 的高表达状态下可以通过促使JAK-2/STAT-3 通路的激活来促使乳腺癌细胞扩散，而与之相似的是JAK-2/STAT-3通路中的下游产物STAT-3 的表达和磷酸化是LC 细胞血管生成拟态的重要介质［21］。在ZHANG 等［22］的研究中指出，抑制JAK-2/STAT-3 信号通路可显著抑制LC 细胞体外侵袭和血管生成拟态，从而达到抑制LC 细胞生成及侵犯周围组织的作用。从以上叙述中我们不难看出，TMEM2 的高表达状态会促使LC 细胞进一步分化并侵犯周围组织，是导致LC复发的重要影响因素。而在本研究中，复发组患者TMEM2相对表达量显著高于未复发组，这一结果与之前所述的研究类似。而后通过多因素分析结果也提示，上述3 个基因是LC 治疗后复发的独立影响因素，也充分证实了通过多基因mRNA 建立预测模型的可行性，其相关度相较于肿瘤分期等指标更具有说服力。

本研究建立的预测模型针对LC 患者预后的预测ROC结果相对理想，AUC接近0.9，说明该模型用于预测LC 治疗后复发具有较好的可行性。但是该模型的灵敏度及特异度均未超过90%，也说明此模型尚具有一定的提升空间。既往研究［23］中指出，LC与患者吸烟及饮酒具有较高的相关性，但本研究中上述两个问题并未被列为影响LC 的独立因素。通过与该研究比较发现，由于本研究纳入患者时间跨度较长，同时患者例数相对较少，而上述两个占比极易受到样本量的影响导致差异。其次，本研究是单中心研究，地域及生活习惯等因素的影响并未纳入考虑范畴，而进食辛辣刺激及腌渍食物对于LC肿瘤的影响不容忽视。

综上，血清CKAP4 mRNA 相对表达量、血清pp-GalNAc-T2 mRNA 相对表达量、血清TMEM2 mRNA相对表达量是LC患者治疗后复发的影响因素，基于上述影响因素构建的预测模型对LC 治疗后复发具有较高的预测价值，但该模型仍需进一步完善并进行大规模验证后方可用于临床。