混合分离分析法在水产动物基因定位中的应用

郭亚东，王文权，孟乾，徐大凤，李雪燕，于雯雯*

（1.如东县渔政监督大队，江苏 南通 226241；2.江苏省海洋水产研究所，江苏省鱼类遗传育种重点实验室，江苏 南通 226007；3.烟台市芝罘区现代海洋产业发展促进中心，山东 烟台 264001）

对目标性状关联基因进行筛选和定位，是水产动物遗传育种研究的前提和基础。传统的基因定位方法，需要对整个遗传群体进行多态性标记分析，成本较高。混合分离分析法（Bulked segregant analysis, BSA），是根据研究的目的性状，从子代分离群体中，选取2 组表型差异的极端个体，分别等量混合构建DNA 池，进行标记差异分析，2 池间的DNA 差异片段即为候选区域。该方法可以相对较低的成本，快速检测分子标记与目标性状的关联，常被用于生物体极端性状相关基因的定位与挖掘[1]。

BSA 技术最早由Michelmore 等[2]，于1991年应用于莴苣抗霜霉病基因相关标记的筛选，成功获得3 个与霜霉病抗性基因Dm5/8 紧密连锁的RAPD标记。BSA 法在农作物基因筛选与定位中应用最为普遍[3]，在畜禽[4]、林木[5]、水产动物[6]研究中，也显示出巨大的应用潜力和发展前景。随着分子标记技术和近10年来新一代测序（NGS）技术的发展，BSA 方法和技术体系也逐渐得到发展和完善。与此同时，不断降低的测序成本加速了基于NGS 的BSA 在水产中的应用。现对BSA 技术在水产动物方面的应用研究，特别是基于测序的BSA 方法在基因定位上最新研究进展进行综述。

1 基于传统分子标记的BSA 法

BSA 技术的进步，依赖于分子标记技术的发展。在测序成本大幅降低之前，BSA 方法主要采用传统分子标记技术，如限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、简单序列重复（SSR）、扩增片段长度多态性（AFLP）等。

1999年，Palti 等[7]首次将BSA 方法用于水产动物目标基因筛选，利用抗传染性造血器官坏死病（IHN）的切喉鳟（Oncorhynchus clarki）与虹鳟（Oncorhynchus mykiss），杂交获得16 个全同胞杂交家系，这些家系在受IHN 病毒攻击后，收集易感群体和耐受群体，采用RFLP 标记技术和BSA 方法，获得33 个差异性位点。此后，BSA 被广泛应用于水产动物目标基因的筛选与定位研究，尤其是在性别研究领域。Felip 等[8]利用BSA-AFLP 法，在虹鳟中筛选出19 对与性别相关的AFLP 引物，并将其中15 个转化为特异性序列扩增（SCAR）标记，其中1个标记被成功定位于Y 染色体的性位点附近。Lee等[9-10]采用BSA 方法，从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中分别获得了与性别相关的8 个SSR 标记和3 个AFLP 标记。此外，BSA 法结合传统分子标记技术，还被应用于日本对虾（Penaeus japonicus）[11]、斑节对虾（Penaeus monodon）[12]、巨骨舌鱼（Arapaima gigas）[13]性别基因相关研究中。BSA 法在贝类壳色和鱼类耐温、虾类生长相关研究中，也取得一些进展。Qin 等[14]通过将橙壳色与白壳色海湾扇贝（Argopecten irradians）杂交，获得F1 代分离群体，采用BSAAFLP 方法，筛选出6 个与壳色显著相关的标记，这6 个标记全部位于同一个连锁群，且其中一个标记（F1f335）与橙壳基因完全连锁。Ge 等[15]采用BSA法，在太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）中筛选出7 个与壳色紧密相关的多态性AFLP 片段，成功开发了1 个共显性SCAR 标记，并将其整合到先前构建的连锁图谱中。Chen 等[16]使用BSA 方法，筛选和鉴定了与大黄鱼（Larimichthys crocea）耐热性相关的4 个SSR 扩增片段，这些片段被克隆和测序后，显示核心序列都是“AC”重复。袁晨浩[17]也采用BSA-SSR 技术，在红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）耐低温和不耐低温群体间，筛选出3 个有显著差异的扩增片段。在生长性状相关基因的研究方面，He 等[18]采用BSA方法，结合RAPD 技术，筛选与中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）生长性状相关的候选标记，获得了9 个与生长性状相关的RAPD 标记，其中包括7 个正相关和2 个负相关，并最终转化获得2 个差异性的SCAR 标记。随着NGS 技术的发展，传统分子标记技术逐渐被边缘化，基于传统分子标记技术BSA在水产动物基因定位中，也逐渐被淘汰。

2 基于转录组测序的BSA 法

随着NGS 技术的研究进展，使得通过转录组测序（RNA-seq）分析，可以在转录组水平上快速、全面的了解变异，将BSA 与RNA-seq 相结合的综合技术方案又被称为BSR（Bulked segregant RNAseq），将对基因表达和基因定位的研究相结合，通过检测单核苷酸多态性（SNP）和计算基因频率，寻找控制不同性状的关键基因[19]。

BSR 技术于2012年在植物研究中被较早报道[20-21]。2013年，Wang 等[22]较早将BSR 技术应用于水产动物基因研究，筛选（Ictalurus sp.）肠道败血症（ESC）抗病相关基因，在易感鱼和抗性鱼中，分别鉴定出1 240 和224 个基因于ESC 感染后差异表达，获得17 个可能与抗病相关的候选基因。该研究认为，BSR 技术较基因芯片分析技术更加灵敏、成本更低，尤其适用于对各种表型性状相关基因进行分析。Dai 等[23]使用剩余采食量（RFI）作为饲料效率的衡量标准，通过BSR 分析，获得11 026 个在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）高效和低效集群之间表现出显著等位基因失衡的SNP 标记，其中568 个标记位于差异表达基因中。Wang 等[24]在凡纳滨对虾Zoea I 幼体阶段，获得了60 个雌性和雄性之间的差异表达基因，注释了其中41 个基因，并最终获得了2 个与性别完全连锁的基因，这2 个基因可能位于凡纳滨对虾的性别决定区域。Liu 等[25]利用基于基因组和遗传连锁群的BSR 分析，将卵形鲳鲹（Trachinotus blochii）的耐缺氧相关SNPs，定位于18 和22 号连锁群，并在肝脏中获得17 个差异表达基因。对这些基因的注释分析表明，葡萄糖和脂质代谢的平衡，在鱼类缺氧耐受性中起着关键作用。2019年，Wan 等[26]将BSR 与GWAS 分析方法相结合，在大黄鱼中发现了IL10、THBS1、IGSF21 等9 个抗香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）感染的基因，获得了5 个可以解释56.6%的遗传变异的SNP 标记。上述研究表明，借助BSR 与GWAS 方法，分别在转录组和基因组水平鉴定候选基因，可以有效提高候选基因筛选的准确性。

3 基于基因组测序的BSA 法

随着NGS 成本的不断降低以及第三代测序（PacBio 或Nanopore 测序）和Hi-C 技术的广泛应用，主要水产养殖动物全基因组测序均已完成[27]，为表型性状相关基因的筛选和定位提供了极大的便利。尽管测序成本大幅下降，但在种群规模上，对每个个体的基因组重测序进行遗传分析，仍然局限于少数模式物种。采用BSA 方法，从2 个具有相对性状的群体中，构建DNA 混合池，进行混池测序（Poolseq），可大幅降低测序成本，且可无偏地从大量个体中确定全基因组等位基因频率[28]，快速检测和注释与性状相关的基因位点，是一种经济高效的方法，适合在表型性状明显分离的群体中定位相关基因。

2019年，Wan 等[29]采用全基因组重测序和BSA方法，鉴定了与团头鲂（Megalobrama amblycephala）肌间刺（IB）数相关的SNP。分别在6 号和11 号染色体，获得了2 个SNP 富集区域，使用52 个SNP 进行数据可靠性验证，其中5 个SNP 与IB 数性状显著相关。Cui 等[6]也采用此方法获得了3 个与IB 数量显著相关的SNP，这些标记有效提高了IB 性状的表型解释率，对鲤标记辅助选择育种具有重要意义。在基因组数据的基础上，将BSA 法与其他基因定位方法相结合或采用多种BSA 算法联合分析，可有效提高基因定位精度。Luo 等[30]在基因组重测序基础上，通过BSA 结合全基因组关联分析（GWAS），在转基因黄河鲤（Cyprinus carpio L）中，从最初筛选出的含48 个SNP 标记的23 个生长相关候选基因中，成功鉴定了2 个生长相关基因。Zhang 等[31]收集了37 个黄姑鱼（Nibea albiflora）红头病易感和抗病群体的样本，进行Pool-seq 测序后，采用χ2检验、logit 回归分析和G'值算法3 种BSA 算法联合分析，将抗红头病基因定位在22 号染色体上10.90~13.11 Mb。通过功能基因注释，在该区域发现了12 个参与免疫反应的基因，主要基因均存在于NF-κB 信号通路，提示该信号通路可能在红头病抗性中起重要作用。

4 讨论

随着NGS 技术的发展，基于测序的BSA 技术，在许多物种检测中得以应用，大大减少了整体测序量和数据分析的工作量，该技术不仅提高了性状相关基因的检测效率，而且降低了测序成本，成为目前较为流行的基因定位方法。该技术也存在不足之处，如无法精细定位基因的区间，比较适合于质量性状基因定位。对于数量性状位点（QTL）来说，只能对其主效的QTL 进行标记定位，对于微效QTL 则无能为力，而且灵敏度和精确度要低于其他的QTL 定位方法。所以在数量性状基因定位方面，BSA 法应用较少，主要集中在抗性性状相关基因方面。目前大多数与BSA 相关的报告，仅提供性状的初始定位结果，通常具有几兆的碱基的分辨率。因此，如何在BSA 作图的基础上精细作图，尤其是提高数量性状相关基因定位精度，可采取以下策略进一步提高定位精度。

（1）增加具有极端表型的分离群体的大小，水产动物一般繁殖能力较强，适当扩大群体规模，可以覆盖更多的重组体，从而提高重组热点区域的定位分辨率。

（2）采用BSA 方法进行初级作图，得到一个峰相对较高（可靠性高）的作图区间，设计一个均匀分布的基于SNP 的竞争性等位基因特异性PCR（KASP）标记，或裂解扩增多态性序列（CAPS），从不包含在极端池中个体的分离群体中，随机选择数百个体进行基因分型，构建目标区间的遗传图谱和QTL 图谱[32]。

（3）将BSA 与多组学相结合，也是实现精细定位和候选基因筛选的有力策略。例如，BSA 和转录组分析联合，进行共定位，在定位区间内的差异表达分析，有利于候选基因筛选[33]；BSA 结合自然种群的GWAS 分析，能提高定位精度[34]。

（4）采用合适的算法或多种算法联合分析。欧氏距离法（ED）、SNP-index 法和G' 值法是目前常用的几种定位算法。ED 法无须双亲基因信息，但高度依赖遗传分离群体（如，双亲杂合度高的F1 群体），适合对水产动物进行基因定位，但易产生假阳性；SNP-index 法得到的定位区间较大，但显著性较低，对数量性状基因定位的敏感度较低；G'值法具有较低的假阳性率，定位精度也更高，但不具备校正其他干扰因素的能力[35]。综合采用多种算法进行基因定位，也可有效提高定位精度[31]。

随着越来越多的水产动物全基因组测序完成，以及相关算法和软件的逐步完善，采用BSA 方法进行基因定位的精度和准确性，都会有很大提高，在水产动物性别、体色、抗性、生长等性状相关基因精细定位中的重要性，将日益凸显，成为水产动物遗传育种研究的重要工具。