应用DNA 条形码技术对口岸截获鱼翅物种进行鉴定与分析

虞惠贞 赵相鹏 裘慧 张明哲 尹文秀 张荃 沈旭芳 李炎锟 吴姗*

（1.浙江省检验检疫科学技术研究院 浙江杭州 310016；2.中国海关科学技术研究中心）

0 引言

鱼翅，主要为软骨鱼系鲨鱼翅和某些鳐鱼翅[1]，取自鲨鱼和鳐鱼的背鳍、胸鳍、腹鳍、臀鳍和尾鳍等，富含大量的胶原蛋白， 具有提高免疫力和美容养颜等功效，深受消费者喜爱[2]。据报道，亚洲的鱼翅年进口量高达20 000 t[3]，香港是全球鱼翅贸易中心[4-5]，市售鱼翅主要为大青鲨、灰鲭鲨、镰状真鲨、长尾鲨等10 多种鲨鱼和鳐鱼[6-8]。鲨鱼和鳐鱼在全球范围内被捕捞，且因其固有的生物学特性，即生长速度慢、繁殖力低、成熟期较晚和妊娠期相对较长[9-10]，导致生产力相对较低， 许多鲨鱼和鳐鱼种群被认为受到威胁或濒临灭绝。在国际自然保护联盟（IUCN）评估的1 038 种鲨鱼和鳐鱼红色名录中， 约20%受威胁物种被归类为极度濒危、濒危或易危物种，另有12%被归类为近危物种[11]。 此外，《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅱ列出了真鲨科（2023 年11 月25 日起生效）、长尾鲨属、双髻鲨科、蓝吻犁头鳐属、圆犁头鳐科、犁头鳐科所有种和其他6 种鲨鱼和鳐鱼[12]。

因此， 必须通过出口许可制度控制其国际贸易（CITES，2023），为严格执行《濒危野生动植物种国际贸易公约》，必须采用鉴定技术在全球鲨鱼产品交易中准确识别出这些物种。然而，由于鲨鱼和鳐鱼的种类较多，亲缘关系和形态特征相似，不易区分，给海关监管工作带来了一定的难度， 故建立快速精准的鱼翅鉴定技术对打击鱼翅走私、 保护海洋生物多样性具有重要意义。

目前，鱼翅的鉴定方法主要包括形态学鉴定、理化鉴定和分子生物学鉴定。完整的、未经处理的鲨鱼标本通常可以由专业分类学家使用形态学指标在物种层面上进行鉴定[13]。通过非线性复合滤波器（傅立叶变换）对完整的干鲨鱼背鳍图片进行处理，可高效地识别部分鱼翅物种[14]。然而，这些产品类别是特定的，通常不适用于分类物种鉴定或物种组成的确定。稳定同位素[15]、红外光谱[16]和电子显微镜分析[17]方法也常被用于干鱼翅的鉴定， 但是这些方法无法准确判定鱼翅的物种来源。

随着分子生物学技术的发展， 研究人员已经开发了许多基于DNA 的分析方法来识别鲨鱼和鳐鱼物种。 这些方法主要基于聚合酶链式反应（PCR）用于扩增通用或物种特异性DNA 区域，主要为特异性PCR、多重PCR、DNA 条形码和荧光PCR 等方法。特异性PCR 技术， 即利用鲨鱼的特异性DNA 引物鉴定特定种类的鲨鱼，通过PCR 产物片段的大小来确定鲨鱼物种[7]，该方法快速且廉价，适合在资源有限的情况下常规使用，仅限于对少数物种的检测。根据鲨鱼线粒体的细胞色素氧化酶I 基因（COI）序列设计鲨鱼通用特异性引物， 鲨鱼有效的扩增片段大小为228 bp，其他物种则无片段[18]，该方法可以鉴别鱼翅的真伪， 但无法鉴定鲨鱼的种类。 多重实时荧光PCR 技术，能够在1 次反应中完成双髻鲨、长尾鲨、鼠鲨等9 种鲨鱼的高效快速鉴定[19]，该方法的设计和条件优化成本较高，通用性较差，只能鉴定特异物种。

DNA 条形码是一种基于测序的技术，利用通用引物靶向1 个短的标准化遗传区域来鉴定物种[20]，通过DNA 条形码进行鉴定的基础是种内遗传差异低于种间差异[21]，将未知序列与参考数据库进行对比，最终鉴定出物种。 DNA 条形码也被用来揭示鲨鱼产品的标签错误， 以及受威胁和濒危鲨鱼物种的贸易。 PAZARTZI 等[22]使用鱼类通用条形码对87 份样品进行鉴定，发现高达56%的样品在销售时存在标签错误的问题，其中23%的物种被列入CITES 附录。WARD 等[23]通过对来自澳大利亚水域的210 种鲨鱼和鳐鱼进行DNA 条形码鉴定，验证了COI 条形码在软骨鱼类鉴别方面的有效性，以及在解决分类学问题和发现新物种方面的实用性。 但是在鱼鳍被加工成鱼翅的过程中，DNA 会被降解和高度碎片化[24]，对鉴定效果产生影响。FIELDS 等[25]开发了一种用于鲨鱼物种识别的微条形码分析方法， 该方法针对全长COI 条形码中较短的110～130 bp 区域， 在100%的加工鱼鳍和62%的鱼翅汤样本中有效识别出了鲨鱼的物种或属水平， 表明在其他高度加工的鲨鱼产品（如鲨鱼软骨补充剂）中，鲨鱼迷你条形码分析方法有用于物种鉴定的可能。 ROSALEE 等[26]使用3种不同条形码对35 种鲨鱼产品进行鉴定，综合鉴定效率为74.3%，其中鲨鱼微DNA 条形码的鉴定效率最高（54.3%），哺乳动物（45.7%）和鱼类DNA（8.6%）条形码的鉴定效率较低， 表明可通过多种引物的联合使用增加鉴定准确性和成功率。

本研究基于16S rRNA 基因和COI 基因作为DNA 条形码的靶基因，建立快速有效的鱼翅物种鉴定方法，以期打击鱼翅走私，为鱼翅的真伪鉴定和保护海洋鱼类的多样性提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鱼翅样品均为海关口岸截获样品。

1.2 DNA 抽提及浓度测定

1.2.1 样品前处理

干鱼翅：用水将10 g 样本泡发，取泡发后的鱼翅2 g， 用振荡研磨仪 （Bertin Precellys Evolution，Bertin Technologies，法国）充分研磨成细末，研磨程序为：5 500 r/min，20 s，并重复4～6 次。

1.2.2 DNA 抽提

使用DNA 抽提试剂盒 （DNeasy merion Food kit），取200 mg 碾磨后的样本，加入DNA 提取裂解液1 mL，置于恒温振荡仪中，60℃振荡30 min，继续按照说明书进行DNA 抽提， 将抽提后的DNA 溶解于50 μL 水中，测定DNA 浓度，提取过程设置以水替代样品的提取空白对照。

1.2.3 DNA 浓度和纯度测定

通过NanoDrop ND-1000 （Thermo Fisher Scientific， 美国） 超微量分光光度计在260 nm 和280 nm 波长处进行测定，将A260nm处的吸光度值换算成DNA 浓度， 用A260nm和A280nm的吸光度比值（A260/280）表示DNA 纯度。

1.3 PCR 引物

16S rRNA 基因上游引物16Sar：5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′；下游引物16Sbr：5’-CCG GTCTGAACTCAGATCACGT-3′，引物参考PALUMBI等[27]采用的方法。COI 基因上游引物Fish F1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；下游引物FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’，引物参考WARD 等[23]采用的方法。

1.4 PCR 扩增和测序

PCR 扩增体系为25 μL：2×TaqPCR Max Master Mix 12.5 μL，引物各1 μL（10 μmol/L），DNA 模板2 μL（10～30 ng/μL），ddH2O 8.5 μL。16S rRNA 基因的扩增条件是：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 个循环；72℃延伸5 min。COI 基因的扩增条件是：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，53℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 个循环；72℃延伸5 min。PCR 扩增产物经纯化后，送至测序公司进行双向测序。

1.5 序列比对及分析

测序结果通过SeqMan 软件进行序列校对和拼接，并删除两端引物序列。将处理过的16S rRNA 序列和COI 序列在GenBank BLAST 数据库进行比对分析。当标本的同一性与参考序列的差异＜2%时，就可以被认为是在物种水平上识别的，100%的同一性得分被用作物种鉴定的截止值[28-29]。

1.6 系统发育分析

根据测序比对结果，从GenBank 数据库下载其他鲨鱼近似种的16S rRNA 和COI 参考序列。 将整理后的拟鲨鱼样品DNA 序列和从GenBank 数据库下载的16S rRNA 和COI 参考序列， 使用MEGA11软件进行多序列比对， 用p-distance 的算法构建邻接法系统发育树， 选用K2P 替代模型，Bootstrap 自展值设为1 000 次。

2 结果与分析

2.1 序列比对结果分析

本研究共获得16S rRNA 基因序列和COI 基因序列各28 条，将获得的序列在GenBank BLAST 数据库进行比对分析，物种鉴定结果见表1。

表1 28 种鱼翅16S rRNA 基因和COI 基因在NCBI 数据库的鉴定结果Table 1 Identification results of 28 sharks based on 16S rRNA and COI Gene in the NCBI database

16S rRNA 基因比对结果显示， 在成功获得的28 个鱼翅样本的16S rRNA 序列中， 有21 条序列在GenBank 数据库均能得到准确鉴定，且鉴定结果一致，物种序列相似度＞99.8%。 此外，7 号、9 号、10号和16 号鱼翅出现相似度高的前3 序列均为镰状真鲨，物种序列相似度最高为99.32%，初步判定为镰状真鲨。 8 号鱼翅出现相似度高的前3 序列为3种不同的真鲨属物种，物种序列相似度均＞99.40%；19 号鱼翅出现相似度高的前3 序列为3 种不同的双髻鲨属物种，物种序列相似度均＞98.00%；27 号鱼翅出现相似度高的前3 序列为3 种不同的真鲨属物种，物种序列相似度均＜98.00%。

COI 基因比对结果显示，26 个鱼翅样本的COI序列在GenBank 数据库均能得到准确鉴定，且鉴定结果一致，物种序列相似度≥99.7%。 此外，将7号和16 号鱼翅在BLAST 数据库中进行比对， 相似度达100%的物种有2 种结果，分别为镰状真鲨和短尾真鲨。

综合分析2 组比对数据的结果可知，共28 个鱼翅样本来源于13 种鲨鱼物种：1 号～4 号及24 号为尖吻鲭鲨；5 号、6 号、13 号、17 号以及20 号～23 号为无沟双髻鲨；7 号、9 号、10 号和16 号鱼翅为镰状真鲨；8 号鱼翅为长鳍真鲨；11 号鱼翅为牛鲨；12 号鱼翅为黑边鳍真鲨；14 号鱼翅为乌翅真鲨；15 号鱼翅为浅海长尾鲨；18 号鱼翅为路氏双髻鲨；19 号鱼翅为小眼双髻鲨；25 号和26 号为大青鲨；27 号为小尾真鲨；28 号为鼬鲨。从NCBI 中下载与鉴定出的鲨鱼物种相似度达98%以上的16S rRNA 基因序列49 条，以及COI 基因序列64 条。

2.2 系统发育分析

2.2.1 鱼翅16S rRNA 基因序列分析

构建77 个鲨鱼16S rRNA 基因 （28 个样本序列和49 条参考序列）的系统发育树（图2），可见大部分鱼翅样本的同一物种的不同个体基本都能聚合在一起， 且置信度均＞70%，50%以上的置信度被认为是可能发生的关系[30]，这一结果与BLAST 数据库比对结果一致。 8 号鱼翅与真鲨属多个物种的相似度达到98.00%以上， 其中与长鳍真鲨相似度达到99.83%，分析树显示8 号鱼翅与长鳍真鲨聚合成一支，且置信度为69%，因而可判断8 号鱼翅为长鳍真鲨。 7 号、9 号、10 号和16 号鱼翅序列BLAST 数据库比对结果为镰状真鲨，但在系统发育树中，4 个鱼翅虽然与镰状真鲨参考序列聚合在一起， 不同个体与参考序列形成的聚类关系的置信度并不高，只有59%， 检测样本序列与参考序列之间亲源性不够，可能是造成上述现象，需丰富参考序列信息，扩大采样量。 19 号鱼翅的16S rRNA 序列与2 种双髻鲨属物种的参考序列聚合成在一起，经对应的聚类关系鉴定无法确定所属物种。27 号鱼翅的16S rRNA 序列与真鲨科物种聚合在一起，无法确定其所属物种。

图1 基于16S rRNA 基因片段序列构建的鱼翅物种系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of shark fins based on 16S rRNA gene

图2 基于COI 基因片段序列构建的鱼翅物种系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of shark fins based on COI gene

2.2.2 鱼翅COI 基因序列分析

构建92 个鲨鱼COI 基因（28 个样本序列和64条参考序列）的系统发育树显示（图3），大部分鱼翅样本同一物种的不同个体基本都能聚合在一起，且置信度均达到60%以上，这结果与BLAST 数据库比对结果一致。 7 号和16 号鱼翅BLAST 数据库比对结果为镰状真鲨和短尾真鲨， 分析树显示这两种鱼翅与镰状真鲨和短尾真鲨聚合在一起， 且置信度达到86%， 说明这2 种真鲨属物种COI 序列非常相似，在这个基因区间无法区分。

2.2.3 综合分析

COI 基因和16S rRNA 基因的系统发育树分支拓扑结构总体趋于一致，验证了DNA 条形码鉴定结果的准确性。COI 基因在本次试验中无法有效区分镰状真鲨和短尾真鲨，16S rRNA 基因可以能有效区分两组真鲨物种，说明在该基因区间内，两种真鲨的序列差异大；COI 基因鉴定19 号鱼翅为小眼双髻鲨和27 号鱼翅为小尾真鲨，基于16S rRNA 序列无法鉴定出此样品的原因在于GenBank 数据库中并没有小眼双髻鲨和小尾真鲨的相关片段（即缺少该物种16S rRNA 基因片段以及线粒体全基因组序列），通过已知序列无法基于16S rRNA 基因对该鱼翅样品进行准确鉴定。 基于已确定的COI 基因序列的鉴定结果可对16S rRNA 鉴定结果进行补充。CHUN 等[31]在使用16S rRNA 基因序列对原生动物进行物种鉴定时，同样也出现相关匹配序列缺少，这是利用16S rRNA 基因鉴定的主要障碍之一。

2.3 已鉴定物种的保护现状

镰状真鲨，长鳍真鲨，黑边鳍真鲨，乌翅真鲨，小尾真鲨，牛鲨，大青鲨和鼬鲨均属于真鲨科物种；路氏双髻鲨， 无沟双髻鲨和小眼双髻鲨均属于双髻鲨物种；尖吻鲭鲨属于鼠鲨科物种；浅海长尾鲨属于长尾鲨科物种，以上物种均列入《CITES 公约》附录II。

2.4 鱼翅物种鉴定方案

本次研究中，16S rRNA 基因和COI 基因对鲨鱼物种鉴定结果表明，DNA 条形码技术能对绝大多数鲨鱼物种进行准确鉴定。 目前Genbank 数据库中有关鲨鱼物种COI 基因的信息较多，涵盖的物种数量和种类比较齐全， 相对来说鲨鱼16S rRNA 基因的信息较少，涵盖的物种数量和种类也较少。但根据本次鉴定结果，鉴定鱼翅样本，建议两种引物联合使用，可以相互验证，提高鉴定准确性。

3 结论

本研究应用通用引物扩增口岸截获28 个鱼翅的线粒体16S 核糖体RNA 基因（16S rRNA）和细胞色素氧化酶Ⅰ基因（COI）部分序列进行基因库比对和构建NJ 分子系统发育树分析， 共鉴定2 目4科6 属13 种物种，且均列入《CITES 公约》附录II。基于16S rRNA 基因和COI 基因的DNA 条形码技术可以有效应用于大部分鱼翅物种的鉴定，2 个基因对同一种鱼翅物种的鉴定结果基本一致， 鉴定有差异部分可以互补鉴定。 因而建议鉴定鱼翅可以先用COI 基因进行初次鉴定，16S rRNA 作为补充条形码基因鉴定。 此外，16S rRNA 目的基因在序列长度上更短，更适合加工食品。本研究提供的鱼翅物种鉴定方案可对鱼翅物种进行准确快速的鉴定， 为打击濒危鲨鱼走私、 滋补品真伪市场监督管理和保护鲨鱼资源提供技术支持。