茶树响应低温胁迫的分子机制研究进展

徐晓莹，黄文尉，张丽霞

山东农业大学 园艺科学与工程学院，山东 泰安 271018

茶树[Camelliasinensis（L.）O.Kuntze.]是我国具有传统优势的重要经济作物，具有喜温暖湿润气候的特性，因此低温是茶叶生产极易遭遇的非生物胁迫之一。低温胁迫可根据低温程度的不同分为冷害（0～10℃）和冻害（＜ 0℃）两个类型。环境温度的波动会引起植物细胞膜流动性的改变，而低温可导致细胞膜硬化并造成细胞骨架的重排，继而引发贮存于细胞液泡中的Ca2+流向细胞质，触发低温响应。茶树感受冷信号后，胞内Ca2+和ABA等第二信使可接收低温信号并继续将其向下游传递，最终引起茶树抗寒性能的提高。

为了减轻低温胁迫对茶树生长发育和茶叶产量、品质的影响，我国茶叶科技工作者开展了茶树抗寒品种选育、茶树抗寒生理生化机理等研究，并取得了一系列进展[1-4]。近年来，为了给抗寒茶树种质资源评价和抗寒茶树品种分子育种提供有价值的遗传信息和基因资源，茶叶科技工作者对茶树响应低温的分子机制进行了深入研究。目前，已鉴定了大多数与茶树响应低温信号相关的组分基因及其转录因子，同时对其在不同耐寒品种、组织中的表达差异以及与低温胁迫的响应关系进行了研究。

本文重点对近年来在茶树中鉴定的参与低温胁迫响应的信号转导组分和转录调控因子的种类与功能进行综述，同时简要介绍茶树响应低温胁迫的转录后调控和翻译后修饰，并提出今后的研究重点。

1 茶树响应低温信号传导途径中的组分

目前在植物响应低温过程的研究中了解较为清晰的冷信号传递途径有两个，即钙依赖型信号传递途径和ABA依赖型信号传递途径。在钙依赖型信号传递途径中，Ca2+作为植物信号转导途径中的第二信使，通过与胞内Ca2+信号受体相结合，从而将环境中的低温信号转变为胞内信号，进一步诱导抗寒相关基因的表达。在ABA依赖型信号传递途径中，低温胁迫会引起植物自身ABA的累积效应[5]，ABA可间接激活ABA应答元件结合蛋白（ABA responsive element binding protein，ABRE）/（ABRE binding factors，ABF），该蛋白可调控ABA响应基因的表达，最终提高植物对低温环境的适应能力[6]。

1.1 茶树低温响应途径中的钙信号受体

目前已知的Ca2+信号受体包括钙调蛋白（Calmodulin，CaM）、类钙调蛋白（CaM-like protein，CML）、钙调磷酸酶B类蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL）和Ca2+依赖蛋白激酶（Ca2+-Dependent protein kinase，CDPK或CPK）等。

在低温胁迫下，茶树叶片中CsCaMs基因表达量逐渐上升，而在被钙调素拮抗剂处理过的叶片中该基因的表达被抑制，由此可以间接说明钙调素参与调控茶树低温响应并发挥重要作用[7]。崔桥云[8]克隆了5个茶树CML基因，除CsCML18-1仅有1个EFBD结构域外，CsCML16、CsCML18-2、CsCML42和CsCML38这4个基因都具有2个Ca2+保守结构域，且这4个基因在低温胁迫下均表现为上调表达。陈思文等[9]研究发现，茶树CsCML16蛋白与拟南芥、小麦等的类钙调蛋白具有高度同源性，且在细胞膜和细胞核中均发现了CsCML16蛋白分布，这表明该蛋白可能在细胞膜信号转导和调控核基因表达水平过程中发挥关键作用。

茶树CsCIPK基因响应低温胁迫且其表达具有组织特异性，在茎和根中表达量明显高于叶中的表达量[10]。冯霞等[11]的研究发现，CsCIPK12具有与CBLs结合的结构域，其表达受低温强烈诱导，可能通过参与糖和ABA等信号途径调控茶树响应低温胁迫的生理过程，同时有关其具体的调节途径和作用机理的研究有待进一步开展。

低温胁迫处理下，茶树CsCDPK在处理24 h后开始显著上调表达，且随着低温胁迫处理时间的延长，72 h时CsCDPK的表达量与对照组相比上调了约5.1倍[12]，而CsMAPKK3基因的表达量呈显著下调趋势，在处理24 h时降到最低值[13]，这表明两基因均响应低温胁迫，但其表达产物的具体相互作用及调控机制还需深入研究证明。

1.2 茶树低温响应ABA信号途径组分

在ABA依赖型信号传递途径中，核心组分包括三类物质：ABA受体PYLs（Pyrabactin resistance1/PYR1-like/regulatory components of ABA receptors，PYR/PYL/RCAR）、蛋白磷酸酶2C（2C type protein phosphatases，PP2C）家族蛋白和蔗糖非酵解型蛋白激酶2s（Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2s，SnRK2s）。

张永恒等[14]克隆了茶树SnRK2家族的两个基因CsSnRK2.1和CsSnRK2.2，与烟草、小麦等作物的SnRK2基因都被低温持续诱导不同，CsSnRK2.1和CsSnRK2.2仅在低温处理4 h时上调表达，这表明这两个基因虽参与低温胁迫响应，但很可能不是关键基因。同时，SnRK2可以通过ABA依赖和ABA非依赖两条途径参与非生物胁迫响应[15]。研究表明：ABA处理24 h内，CsSnRK2.1能被ABA诱导上调表达，而CsSnRK2.2表达水平始终无显著变化，表明CsSnRK2.1可能参与了ABA依赖的信号传递，而CsSnRK2.2主要通过ABA非依赖途径参与植物响应胁迫过程。

2 茶树低温信号应答中的转录因子

转录因子是目前抗寒研究的热点[16]，它一般包含DNA结合域、转录功能域、核定位信号和寡聚化位点等4个结构域，可被上游磷酸化信号激活并结合在靶基因的启动子序列上，从而调控抗寒基因的表达。目前，ICE-CBF-COR低温信号通路在模式植物拟南芥中的研究已较为清晰，这为其他植物抗寒分子机制的研究提供了必要的理论基础[17]。在茶树中，近年来已鉴定的响应低温转录因子包括ICE-CBF-COR信号途径中的ICE及CBF；此外，还包括响应低温胁迫的WRKY、NAC、TIFY等转录因子。

2.1 ICE-CBF-COR信号通路中的转录因子

冷调控基因（Cold-regulatedgene，COR）是在低温条件下大量表达的一类基因，也被称为“低温诱导基因”，其表达产物对细胞膜系统起到稳定作用，在植物响应低温胁迫中发挥着重要作用[18]。在COR启动子上含有C-端重复/脱水应答元件（C-repeat/dehydration responsive element，CRT/DRE），C-端重复结合因子/脱水应答元件结合因子（C-repeat binding factor，CBF/dehydration responsive element binding factor，DREB）可与之特异性结合，从而激活或抑制COR基因的转录表达。同时，CBF/DREB调控基因的表达又受到ICE（Inducer of CBF expression）转录因子的调控，从而形成ICE-CBF-COR低温信号响应通路。

2.1.1 CBF/DREB转录因子

CBF/DREB是一类隶属于AP2/ERF（APETA LA2/ethylene-responsive factor）家族的转录因子[19]，具有AP2（APETALA2）保守结构域，该结构域能够特异性结合靶基因启动子上的CRT/DRE元件，从而调控基因的表达[20]。在植物中主要存在不依赖CBF/DREB和依赖CBF/DREB的两种低温调控机制，且后者在拟南芥等模式植物中研究较深入[21]。

目前探明的茶树CsCBFs基因家族有5个成员，低温胁迫下CsCBF1、CsCBF2、CsCBF3和CsCBF5均有不同程度的响应，而CsCBF4无显著差异表达，且随着处理时间的延长，CsCBF1、CsCBF2、CsCBF3和CsCBF5等4个基因的表达量呈明显上调趋势。但不同茶树品种之间存在较大差异，抗寒性强的茶树品种CsCBFs上调幅度显著高于抗寒性弱的茶树品种。冷驯化处理具有同样的变化规律，但14 d的最大表达量高于低温胁迫[22]。以上结果表明除了CsCBF4外，茶树其他CsCBFs基因在茶树抗寒方面均发挥重要作用。马宁[23]通过酵母单杂交试验证明CsCBF3蛋白具有转录激活活性，且能与调控低温、脱水等逆境的基因启动子上的顺式作用元件CRT/DRF元件特异性结合。Ying Yin等[24]的研究证实，茶树CsCBF3基因能被低温以及ABA、干旱诱导，将CsCBF3基因在拟南芥中过表达后，下游AtCOR15a和AtCOR78被诱导表达，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐寒性增强。以上结果有效验证了CsCBF3在应对冷胁迫方面的重要作用。刘志薇等[25]从茶树品种‘迎霜’中克隆得到CsDREB-A4基因，低温胁迫处理下该基因在3个茶树品种（‘迎霜’‘安吉白茶’和‘云南十里香’）中均有响应，但响应水平存在明显差异，该研究证明了CsDREB-A4转录因子在茶树抗低温胁迫过程中的调控作用的重要性和复杂性。

2.1.2 ICE转录因子

ICE（Inducer of CBF expression）是一种MYC类转录因子，含有bHLH（Basic/helix-loophelix）结构域，该结构域可与含有MYC顺式作用元件的CBF3基因特异性结合，从而激活CBF3基因的转录表达[26]。

尹盈等[27]研究表明，CsICE基因定位于细胞核且普遍存在于茶树各种组织，但其在茶树叶片中的表达量显著高于根、茎、果中的表达量。在低温胁迫下，茶树叶片中CsICE基因可被快速诱导表达且表达水平显著上调，在低温处理2 h时高达对照水平的20倍。此外，随着低温胁迫处理时间的延长，CsICE基因表达量整体呈现先上升后降低的变化趋势，推测下游基因的上调表达可能存在对CsICE的反馈调节。林郑和等[28]克隆得到茶树CsICE1基因和CsCBF1基因，研究发现低温胁迫初期两个基因的表达均显著增强，表明两个基因均响应低温信号，对茶树适应寒冷和提高后期的抗冻性有着重要作用。

2.2 其他相关转录因子

COR基因表达除了受到CBF/DREB转录因子调控外，还有一些与CBF作用方式类似的冷诱导转录因子也能在低温胁迫下诱导COR基因的表达[29]。下面介绍目前已探明与茶树低温胁迫响应相关的其他几种转录因子。

2.2.1 WRKY转录因子

WRKY结构域家族蛋白含有由60个氨基酸组成的WRKY结构域，可依据其保守结构域的数目及锌指结构类型分成GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ三类[30]。该类转录因子可以识别并结合靶基因启动子区域的W-box（C/T）TGAC（T/C）作用元件[31]，从而激活或抑制下游抗寒相关基因表达，参与调节植物低温响应过程。

Wang Y等[32]从茶树中克隆得到1个GroupⅠ的WRKY基因CsWRKY2，研究结果表明低温胁迫处理下该基因显著上调表达。王鹏杰等[33]利用PCR技术从“铁观音”茶树品种中克隆了GroupⅠ和GroupⅡ2个类型的WRKY基因各4个。在低温胁迫处理0～12 h内，8个基因的表达量均表现上调趋势，且其中5个上调显著；而在处理12～72 h的过程中，除CsWRKY21和CsWRKY23两基因仍有上调外，其余基因表达量均表现为显著下调。王鹏杰等[34]还克隆了分别在老叶、花和根茎中高表达的GroupⅡb亚类的CsWRKY6、CsWRKY31基因和GroupⅡ c 亚类的CsWRKY48基因。这3个基因均被低温（4℃）诱导上调表达，其中CsWRKY6和CsWRKY31的表达量在48 h达到最高，而在处理72 h时CsWRKY48达到其峰值，均显著高于0 h处理。以上研究结果表明，上述CsWRKY转录因子均响应低温胁迫，在茶树响应低温胁迫调控过程中起着重要作用。

2.2.2 NAC转录因子

NAC（NAM/ATAF/CUS2）转录因子是植物特有的最大转录因子家族之一，高度保守的NAC结构域位于NAC蛋白的N端，在识别和结合下游靶基因DNA序列和核定位方面起关键性作用[35]；C端为多变的转录调控区（Transcription regulatory region，TRR），可发挥转录激活或转录抑制功能。

王永鑫等[36]从茶树材料克隆得到CsNAC1基因和CsNAC2基因，它们分别属于NAP和AtNAC3亚家族成员。低温胁迫可诱导‘迎霜’和‘安吉白茶’2个茶树品种中的CsNAC1和CsNAC2基因上调表达，但由于茶树品种和处理时间段的不同，两基因的表达水平存在较大差异。周棋赢等[37]从‘舒茶早’茶树基因组分离鉴定出108个CsNAC基因，分属于16个亚类，其中ONAC022和NAP亚类成员最多。低温胁迫下，CsNAC基因及其共表达基因在淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号传导等与提高植物抗逆性相关的22条途径中富集。低温处理后，茶树中绝大部分CsNAC基因都上调表达，而ANAC0063类、UN-2类的CsNAC大部分成员对低温诱导处理无响应。与此同时，即使是同一类CsNAC成员，它们响应低温胁迫时的表现也存在差异，并不表现为完全一致。以上研究表明，茶树CsNAC转录因子家族中有部分成员参与了茶树低温胁迫调控，同时也反映出其调控的复杂性。

2.2.3 TIFY转录因子

TIFY蛋白因含有高度保守的TIF[F/Y]XG结构域而得名，是陆地植物所特有的转录因子家族[38]。根据其结构域类型，TIFY家族可分为TIFY、ZML（ZIM&ZIM-like）、JAZ（Jasmonate-ZIM-domain）和PPD（PEAPOD）4个亚家族，4个亚家族均含有TIFY结构域，除了TIFY亚家族外，其他三个亚家族各自含有独特功能结构域[39]。

谢思艺等[40]鉴定了22个茶树CsTIFY转录因子家族成员，一半以上的CsTIFY基因均含有胁迫反应元件，且低温胁迫可诱导大部分CsTIFY基因上调表达，其中CsZML1基因表达量显著提高，而且大部分CsTIFY转录因子定位于细胞核，推测CsTIFY蛋白可能与细胞核中的其他蛋白发生互作，从而共同调控低温响应相关靶基因的转录表达。姚新转等[41]鉴定了19个茶树CsTIFY基因，包括2个CsTIFY、7个CsZML、8个CsJAZ和2个CsPPD基因。低温胁迫下，CsTIFY都存在响应，但不尽相同，如CsTIFY8和CsTIFY11被诱导且显著上调表达，随着冷胁迫处理时间的延长，其表达量随之增加，而TIFY2在不同时间段表达差异较小，CsTIFY6的表达水平则呈现先增加后降低的趋势。

3 茶树响应低温信号的转录后及翻译后调控

3.1 茶树响应低温的转录后调控

MicroRNA（miRNA）是一类长度在18～24个核苷酸之间的内源性非编码单链小RNA，它通过降解靶mRNA（植物）或通过与靶mRNA的3'UTR（Untranslated region）结合（动物）来阻断蛋白质翻译，从而主要在转录后水平负调控相关基因的表达[42]。

谢小芳[43]筛选出27个低温胁迫差异表达miRNAs，发现其中13个miRNAs对应的85个靶基因大部分为转录因子，并从中选择5对miRNAs及其靶基因研究了其在低温胁迫下的表达模式，其中miR156、miR164和miR396的靶基因分别为SPL6（SQUAMOSA promoterbinding-like）、NAC1和GRF8（growth regulatingfactor）转录因子，且3个miRNAs表达量均下降，而其对应的靶基因表达上调，由此表明这些miRNAs通过调控其靶基因的表达参与了茶树抗低温胁迫过程。张玥等[44]采用生物信息学分析方法共发现7条分属于6个不同的miRNA家族的茶树miRNA。靶基因预测分析表明：这7条miRNA可能调节有关新陈代谢、生长发育、胁迫应答过程的28种靶基因，其中miRNA319靶向调节一个TCP2转录因子，由此推测miRNA319通过诱导TCP转录因子降解从而在调控茶树低温响应过程中发挥关键性作用。

3.2 茶树响应低温的翻译后调控

蛋白质翻译后修饰在植物逆境分子调控过程中也充当不可或缺的角色。ICE1属于组成型表达基因[26]，在植物组织中维持一定的表达水平，ICE1转录因子的调控主要受蛋白翻译后的修饰调控，蛋白的磷酸化与去磷酸化调控其活性，蛋白的泛素化与类泛素化修饰调控其稳定性和丰度，进而协同调控其下游基因的表达。

岳川等[45]从‘龙井43’材料中克隆了CsSDIR1（Salt and drought induced ring finger1）基因，该基因与HOS1（Highosmoticexpression1）均属于指环结构域的E3泛素连接酶基因。在低温（4℃）胁迫条件下，CsSDIR1的表达受到明显抑制，在处理后的3 h和9 h其相对表达量显著低于对照。虽然目前还没有直接证据表明抑制CsSDIR1基因的表达有利于CsICE1的稳定和保持其丰度，但有研究表明HOS1可将ICE1转录因子泛素化降解，从而降低该低温响应通路下游的CBFs及CORs基因的表达水平，最终影响植物的抗寒性能[46]；而在HOS1突变体中，低温胁迫处理条件下CBFs及其下游靶基因的表达量显著上调。

4 总结与展望

在借鉴模式植物拟南芥及其他作物的低温响应分子机制研究成果的基础上，茶叶科技工作者对茶树中响应低温信号的组分和转录因子进行了较广泛的研究，大部分相关基因得到鉴定，并探明了其在不同茶树品种与组织中的表达特性，明确了与低温胁迫之间的响应关系，由此在茶树响应低温胁迫的分子机制研究领域取得了重大进展。

同时我们也应看到目前有关茶树响应低温胁迫的分子机制主要集中在转录调控环节，转录后调控、翻译后修饰以及表观遗传修饰等方面的研究相对较少甚至还未涉及。此外，乙烯、茉莉酸甲酯、赤霉素等植物激素也都参与茶树对低温的响应，低温信号与植物激素的交互作用机制也有待于深入研究，在调控茶树低温耐受性上，不依赖CBF的下游信号通路还亟待挖掘。