循环肿瘤细胞在结直肠癌患者手术前后变化及其与肿瘤病理因素相关性

王 立, 何维新, 谢 鹏, 贺小武, 余力栋, 严 烁, 周建平

联勤保障部队第九〇六医院1.普通外科(二);2.肝病科,浙江 宁波 315000

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,随着手术、放疗、化疗及靶向治疗等肿瘤综合诊疗手段的不断发展,结直肠癌患者的预后得到明显改善,5年生存率可达65%,但仍有一半以上的患者会在病程中出现复发、转移,并最终导致死亡[1]。寻找合适的分子生物学标记物来评估结直肠癌患者的临床治疗效果及预后是目前丞需解决的问题。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是指由肿瘤原发灶或转移灶进入血液循环的肿瘤细胞,有研究显示,其在恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估等方面均有非常重要的价值[2]。本研究旨在观察CTCs在结直肠癌患者手术前后的变化情况,并分析其与肿瘤病理因素的相关性。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 将联勤保障部队906医院自2018年6月至2020年12月收治的90例结直肠癌患者纳入结直肠癌组。纳入标准:性别年龄不限;接受腹腔镜结直肠癌根治术,无手术禁忌证;经肠镜检查和活组织病理学检查明确诊断为结直肠癌;入组前未接受放疗、化疗等任何术前治疗;签署知情同意书。另将同期的18例结直肠良性疾病(肠息肉等)患者纳入良性组。良性组中,男性11例,女性7例,年龄27～73岁;结直肠癌组中,男性57例,女性33例,年龄37～79岁。两组患者一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 CTCs的分离和富集 采用免疫磁珠阴性富集法完成。每次CTCs检测的5 ml血样取自结直肠癌患者(分别于术前1 d、术后第7天早晨抽肘正中静脉血),血样放置于预先准备好的ACD管中保存。CTCs的分离和富集过程采用基于美晶医疗CellRichTM CTCs检测平台的免疫磁珠法结合密度梯度离心法,去除血液中除肿瘤细胞以外的无关细胞,最后间接分离、富集得到包含CTCs及少量白细胞的细胞悬液,并将此悬液涂片。

1.3 CTCs的荧光原位杂交染色及鉴定 采用免疫荧光原位杂交技术完成。此方法联合了基因水平的荧光原位杂交技术和蛋白水平的免疫荧光染色法,通过染色体计数探针(chromosome enumeration probes,CEP)进行8号染色体着丝粒结合,anti-CD45抗体荧光染色细胞膜,二脒基苯基吲哚(diaminidine phenyl indole,DAPI)染色细胞核,最终鉴别CTCs。

1.4 CTCs判断标准 (1)光镜下有完整的细胞核,细胞呈圆形、椭圆形或长形,细胞长径>10 μm。(2)荧光下细胞形态及边缘完整,荧光染色标准CD45(抗白细胞表面抗原)阴性。(3)细胞核DAPI核染色阳性,细胞核直径>8 μm,且核形状不规则。(4)CEP8阳性的定义为8号染色体探针信号点>2个(呈现异倍体)细胞。结果判读标准示意图:异倍体阳性,DAPI阳性,CD45阴性。见图1。同一个标本中符合上述标准的细胞≥2个视为CTCs阳性。

图1 CTCs鉴定示意图(主机为Leica DM3000,软件版本为Leica Application Suite Version 4.9.0,放大倍数为400倍;a.DAPI染色阳性细胞,代表是细胞核;b.CEP8探针标记阳性细胞,代表该细胞染色体为异倍体;c.CD45染色阴性细胞,代表该细胞非白细胞;d.前3张图叠加的合图,代表为CTCs阳性细胞)

1.5 资料收集 记录结直肠癌组患者的一般资料和病理检查资料,包括性别、年龄、肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移、神经侵犯、脉管侵犯、TNM分期等。

1.6 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件对数据进行处理。计数资料以例(百分率)表示,组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者CTCs阳性率比较 结直肠癌组术前1 d外周血中检出CTCs阳性患者50例,阳性率55.5%(50/90);良性组于肠镜或病理确认后第1天进行外周血CTCs检测,检出阳性1例,阳性率5.6%(1/18)。结直肠癌组CTCs阳性率高于良性组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 结直肠癌组患者外周血CTCs与肿瘤病理因素的相关性 在结直肠癌组中:男性、女性CTCs阳性率分别为63.1%(36/57)、42.4%(14/33);有淋巴结转移、无淋巴结转移分别为62.2%(38/61)、41.4%(12/29);分化程度高、中、低分别为61.7%(21/34)、50.0%(13/26)、53.3%(16/30);年龄≤65岁、年龄>65岁分别为62.2%(23/37)、50.9%(27/53);TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期分别为43.5%(17/39)、64.7%(33/51);肿瘤部位在右半结肠、左半结肠(含直肠)分别为43.2%(19/44)、67.4%(31/46);神经侵犯(+)、(-)分别为62.2%(28/45)、48.9%(22/45);浸润深度T1+T2、T3+T4分别为33.3%(7/21)、62.3%(43/69);脉管侵犯(+)、(-)分别为57.4%(27/47)、53.5%(23/43)。结直肠癌组患者外周血CTCs阳性率与性别、淋巴结转移、分化程度、年龄、神经侵犯、脉管侵犯均无相关性(P>0.05),但与TNM分期、肿瘤部位、浸润深度有相关性(P<0.05)。

2.3 结直肠癌组患者手术前后CTCs阳性率变化 在术后第7天,对结直肠癌组术前1 d外周血中检出CTCs阳性的50例患者进行CTCs复检,结果显示:CTCs数量减少或归零41例(82.0%),CTCs数量无变化5例(10.0%),CTCs数量增加4例(8.0%)。41例CTCs数量减少或归零患者中,浸润深度T1+T2、T3+T4分别有6例、35例;5例CTCs数量无变化患者中,浸润深度T1+T2、T3+T4分别有0例、5例;4例CTCs数量增加患者中,浸润深度T1+T2、T3+T4分别有0例、4例。

3 讨论

癌症转移是世界范围肿瘤相关性死亡的首要因素[3]。临床上缺乏对肿瘤微转移的有效检测手段,导致无法早期发现肿瘤复发及转移。传统的肿瘤标志物、影像学检测及组织活检等,由于诊断阈值设定、肿瘤的时空异质性及取材受限等问题,在癌症患者转移复发评估时能力受限[4]。液体活检为肿瘤早期诊断、预后预测及抗癌药物反应监测提供了一种实时、微创、精准的方法[5-6]。CTCs检测就是液体活检中最重要的组成部分之一,CTCs从原发性或转移性肿瘤脱落到血液中,是可能导致转移的“种子”,由于携带了完整的分子生物学信息,在转移发生的早期阶段,CTCs就提供了捕获最具侵袭性肿瘤细胞的机会[7]。

通过对外周血中CTCs的检测可直接判断外周血中肿瘤细胞的存在与否。有多项研究报道,CTCs已在大多癌种的外周血中被检测到,其预后价值在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌及小细胞、非小细胞肺癌中得到证实[8-10]。CTCs的存在还与肿瘤分期具有明显的相关性,CTCs数量越多,患者面临远处转移的肿瘤细胞负荷越重,未来发生转移的可能性就越大[11]。本研究结果显示:结直肠癌组外周血中确实能够检测到CTCs,阳性率为55.5%;同时,结直肠癌组患者外周血CTCs阳性率与TNM分期、肿瘤部位、浸润深度有相关性(P<0.05)。这与Cohen等[12]研究结果相似。有研究提示,左右半结肠癌可能不只是部位上存在差异,更多差异在肿瘤分子生物学行为上,该差异可能会导致左右半结肠癌的预后及治疗选择不同[13];Nicolazzo等[14]的研究也得出了类似结论。本研究结果还显示:在术后第7天,结直肠癌组术前1 d外周血中检出CTCs阳性的50例患者中,CTCs数量减少或归零41例(82.0%)。这提示,随着原发灶的切除,外周血中CTCs也随之减少或消失,即手术对肿瘤的治疗见效迅速。但仍有10.0%的患者CTCs数量无变化,甚至8%的患者术后CTCs数量增加。进一步研究发现:5例CTCs数量无变化患者中,浸润深度T1+T2、T3+T4分别有0例、5例;4例CTCs数量增加患者中,浸润深度T1+T2、T3+T4分别有0例、4例。即CTCs数量无变化和增加的患者均肿瘤浸润较深(T3/T4)。原因在于,肿瘤浸润较深、肿瘤较大会在术中不可避免地对肿瘤产生挤压等,引起肿瘤CTCs释放入血,还可能是CTCs单次检测的随机误差导致了CTCs数量术后上升。

综上所述,结直肠癌患者术前CTCs的数量与TNM分期、肿瘤部位、浸润深度相关,大多患者的CTCs数量在手术治疗后会下降,对于术后CTCs仍然阳性的患者,建议继续密切跟踪随访。在结直肠癌肿瘤根治性手术中,术中无瘤操作是否妥当可能会影响患者术后CTCs数量,进而影响患者预后。与此同时,也要考虑到目前CTCs的检测技术并不完善,由于外周血中CTCs稀少、分布不均,且在体内的停留时间存在争议[15],导致随机单次采血检测捕获难度和偶然性增加[16],造成检测随机误差,因此,建议在CTCs检测的同时联合ctDNA等液体活检手段,在一定程度上克服CTCs检测的局限性。