抗冻蛋白的制备及其在食品工业的应用研究进展

王静静，廖爱美，刘莹莹，陈新阳，薛迎春，潘龙，黄继红，3，4*，侯银臣

（1.河南工业大学 生物工程学院小麦生物加工与营养功能河南省重点实验室，河南 郑州 450001；2.中原食品实验室，河南 漯河 462000；3.河南大学 农学院 作物逆境适应与改良国家重点实验室，河南 开封 475004；4.许昌学院 食品与药学院，河南 许昌 461000）

由于食品在储存过程中含水量高，利于微生物生长和发生化学反应，容易导致食品腐败变质[1]，而冷冻保存技术是将食品长期保存的最有效方法。受温度波动的影响，食品中的冰晶生长或再结晶，会破坏细胞和组织结构，使食品失去原有品质[2]，并造成一定的经济损失。因此，在食品冷冻储存过程中，找到控制冰晶生长和再结晶的方法对提高冷冻食品的品质至关重要[3]。在冷冻食品中添加冷冻保护剂是缓解冷冻贮藏过程中发生品质恶化的最有效方法之一[4]。抗冻蛋白（antifreeze proteins，AFPs）最初是在南极海洋鱼类血清中发现的，是一种可以防止鱼类在冰冷的海水中结冰的蛋白质[5]。与其他蛋白质不同，AFPs 对冰有独特的作用，它可以通过吸附到冰层表面保留水合分子，保留后的水合分子与冰晶有不同的生长方向和氢键结构，AFPs 可以吸附到冰晶表面来抑制冰晶的形成和冰晶的生长[6-7]。此外，它可以通过降低体液的冻结温度来保障各种冷适应生物的存活，也可以通过抑制冻融过程中产生冰晶从而保护细胞不受伤害[8]。因此，AFPs 可以作为一种新型、无毒害的低温保护剂应用于冷冻食品中。AFPs 可以从生物体中提取，也可以通过人工制备。然而，提取或制备得到的AFPs 粗液包含多种蛋白质，因此，需要进一步的分离纯化从而获得高浓度的AFPs溶液。本文总结了近年来国内外AFPs 的来源、特性、制备与纯化的最新研究，重点论述了AFPs 在冷冻食品中的应用进展，并展望了AFPs 的制备与应用前景，以期为抗冻蛋白的制备、纯化和应用提供参考。

1 AFPs 的来源

AFPs 主要存在于海洋深处、常年积雪和沙漠地区的细菌、真菌、植物、昆虫、脊椎动物体内，是一种能够抑制冰晶再结晶的结构多样化的大分子蛋白质，它可以帮助许多生物体（如鱼、昆虫、植物和细菌等），能够在0 ℃以下的温度中生存[9]。AFPs 有热滞活性（thermal hysteresis activity，THA）、冰重结晶抑制（ice recrystalization inhibition，IRI）和修饰冰晶形态等特性，自然界中不同生物来源的AFPs 的特征有差异[10]。例如，在IRI方面，AFPs 可以通过降低体液中的冰点来阻止鱼类和昆虫冰晶的形成；在修饰冰晶形态方面，植物和线虫的抗冻性是通过将磷酸腺苷结合在冰的表面并防止其变成更大的冰晶来实现的；不同微生物的AFPs 可以附着在冰面上，并抑制冰晶的形成。AFPs 可以抑制冰晶的生长，这对于生活在冰冷海水中的极地鱼类有重要意义[11]。Takeshita 等[12]研究发现，冬牙鲆AFPs 溶液经过预热和超滤后提高了蛋白的纯度，增强了对冰晶生长的重结晶抑制作用。昆虫中AFPs 的抗冻活性显著高于鱼类；植物中的AFPs 具有显著抑制冰晶形态的作用。有研究表明，将AFPs 转入植物体内能够减缓植物冻害[13]，但关于植物中AFPs 的研究起步较晚，文献相对较少。表1 概括了不同生物来源的AFPs，以及它们的代表物种和同源蛋白质。

表1 不同生物来源的AFPsTable 1 Different biological sources of antifreeze proteins

2 AFPs 的特性

AFPs 与冰晶结合，能够通过非依数的形式降低溶液的冰点，并保持其熔点不发生变化；同时，表现出IRI 活性，可以阻止微小冰晶在冷冻、低温保存过程中生长为大晶体，并具有改变冰晶形态的能力[18]。

2.1 THA

AFPs 能够非依数性地降低溶液的冰点而保持其熔点不变，这样冰点与熔点间产生的差值就称为THA，其根据AFPs 和晶体表面之间的相互作用而变化[19]。根据THA，AFPs 可分为中度活性抗冻蛋白和过度活性抗冻蛋白。在鱼类和植物中发现了中度活性的AFPs，在高浓度蛋白质下，其THA 值约为2 ℃，而在高浓度蛋白下，来自细菌和昆虫的THA 值高达5 ℃[20]。在含有AFPs 的溶液中，冰晶不可逆地结合到AFPs上，阻止冰晶生长，直到温度降低到非平衡冰点，从而形成温度差，使冰晶破裂[21]，这种特殊的性质在食品工业及低温保存技术方面存在巨大的应用潜力。

2.2 IRI

AFPs 可以防止水在冰晶和溶液之间的再分配，即IRI。根据这一特性，AFPs 在食品工业中具有潜在的应用价值，例如在制冷系统的冰浆和食品储存中的应用。植物的IRI 活性高于鱼类和昆虫。对于一些耐寒生物体，当空气温度降至冰点以下时，它们的细胞外会形成许多冰晶，AFPs 可以减缓胞内致命冰的形成[22]。冰的重结晶过程分为冰晶边界迁移、大冰晶增大、小冰晶消失。AFPs 可以增加冰晶的数量，减小冰晶的尺寸。一般来说，AFP 的IRI 率越大，形成的冰晶就越小[23]。AFPs 通过阻止冰晶在边界处生长和融化来抑制冰晶边界迁移的过程。即使是在亚微摩尔的浓度中，IRI 也很显著，这远低于THA 所需的浓度。冰晶在冷冻溶液中较小，降低了细胞的损伤，防止冷冻食品在储存过程中营养的流失，因此对于冷冻食品和其他冷冻水合材料的保存有至关重要的作用[24]。Shi 等[25]采用3 种浸渍方法，研究了AFPs 对冻融循环下扇贝内收肌持水能力和质地特性的影响。结果表明，在超声辅助浸渍中AFPs 通过氢键吸附在冰晶表面，可以显著改变冰晶的形态，显著提高扇贝收肌的持水能力和质地特性，为研究超声辅助浸渍及其在冷冻水产品中的作用机制提供一定的参考。

2.3 修饰冰晶形态的能力

AFPs 可以结合到特定冰晶的基面上，从而形成独特的冰晶形态。例如，冬比目鱼和黄颡鱼中的I 型AFPs分别结合在冰锥和副棱柱基面上，来自南极的黄杆菌中超活性AFPs 结合在基面上，形成柠檬的形状，而超活性AFPs 可以同时结合在冰晶的基面和棱柱上[26]。

3 AFPs 的制备

AFPs 可以从天然来源（植物、昆虫、动物和鱼类）中提取，也可以通过常见的基因重组技术制备。对化学法、分子生物学表达、基因工程表达的制备方法进行总结。

3.1 化学法

化学法一般采用的是碱溶酸沉法，依据蛋白质等电点的不同，通过调节溶液的pH 值，使得目的蛋白质沉淀。陈振家[27]采用碱溶酸沉的方法从大豆中制备分离蛋白，通过改性后制成凝胶，在冻藏条件下对蛋白的抗冻特性进行研究，结果表明，随冻藏时间的延长，凝胶特性下降，蛋白降解。丁香丽[28]则以Na2HPO4-NaH2PO4溶液为缓冲液，采用真空渗透法提取大麦籽粒中AFPs，经过超滤、一系列柱层析纯化，得到的大麦籽粒AFPs 相对分子质量为13 370 Da，THA为1.04 ℃，与禾本科小麦族12 个属中的蛋白具有较高同源性。

3.2 分子生物学表达

分子生物学表达技术是指以模式生物（细菌、真菌、动物细胞或者植物细胞）为宿主，对外源基因进行表达的一种方法。张莉等[29]通过构建重组乳酸乳球菌进行诱导表达抗冻肽，比较冷冻胁迫前后乳酸乳球菌的生长曲线、发酵活力和细胞内钠、钾离子含量的变化，研究重组菌在冷冻胁迫作用下的生理功能特性。结果表明，抗冻肽具有显著的抗冷冻胁迫保护作用。Zhao 等[30]将4 种云杉品种的基因转入大肠杆菌宿主中表达，经过诱导、提取、纯化后的可溶性基因蛋白进行差示扫描量热仪测试，其特征THA 分别为0.77 ℃（PicW1）、0.78 ℃（PicW2）、0.72 ℃（PicM）和0.86 ℃（PicK），显著高于对照组（牛血清蛋白）的0.05 ℃。

3.3 基因工程表达

基因工程表达蛋白，是先设计目的基因并在体外构建DNA 分子，然后将基因导入细胞内来表达蛋白质，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。董小云[31]从白菜型冬油菜中分离鉴定出白菜型冬油菜抗冻蛋白（BrAFP1），其分子量为38.130 kDa。让冬油菜幼苗在低温胁迫下生长，结果显示BrAFP1 基因表达上调，表明该基因在白菜型冬油菜低温响应中起着重要作用。Yu 等[32]从沙冬青中克隆出AnAFP 基因，通过实时荧光定量，发现高温对AnAFP、AnICE1 和AnCBF 基因的表达有显著的诱导作用，表明AnAFP 可能受冷胁迫信号调节通路调控。表2 归纳了3 种方法制备AFPs 的优点与缺点。

表2 AFPs 的制备方法比较Table 2 Comparison on the preparation methods of antifreeze proteins

4 AFPs 的分离纯化

通过化学法、分子生物学表达、基因工程表达制备得到的AFPs 粗液是一种复杂的蛋白质体系，包含多种蛋白质，因此，需要进一步的分离纯化从而获得高浓度的AFPs 溶液。冰亲和层析、色谱层析、Ni 柱亲和层析为常见的纯化方法。

4.1 冰亲和层析

冰亲和层析是纯化AFPs 的传统方法。纯化的原理是如果冰晶生长得足够慢，过冷就会被最小化，杂质很难进入晶体，可以通过混合溶液来排除冰中的溶质。冰亲和层析有两种方法可以实现，第一种方法是冰亲和纯化技术，即用黄铜冷指浸入蛋白质溶液中，纯化后的蛋白质在黄铜冷指上缓慢生长，不断搅拌溶液防止杂蛋白结冰；第二种方法是冰壳纯化，即圆底烧瓶浸泡在冷水浴里，低温使烧瓶表面形成薄冰，抗冻蛋白通过吸附到冰的表面以达到纯化的效果[33]。这两种方法都是在容器中混合AFPs 溶液，同时通过程序，利用水浴降低温度，通过融化冰提取纯化的蛋白质。Tomalty 等[34]从实验室冷驯化后的黄粉虫幼虫匀浆中制备出AFPs，经过5 次旋转冰亲和纯化蛋白，测得其热值活性最高为3.5 ℃，幼虫匀浆的上清部分具有大量不同的蛋白质，最高相对分子质量可达175 kDa。与传统的分离纯化AFPs 方法相比，冰亲和层析法更适用于AFPs 较大规模的粗分离纯化，而且电泳条带切割法适用于高精度和高纯度样品地分离[35]。

马庆保[36]以特异性亲和吸附法制备南极磷虾AFPs，优化的提取南极磷虾AFPs 最佳条件为样品浓度1.0 mg/mL、吸附温度-1.70 ℃、吸附时间11 h、吸附次数为2，在此条件下，南极磷虾AFPs 的预测得率为30.12%，THA 为0.079 ℃。

4.2 色谱层析

色谱层析作为一种物理化学分离纯化方法，是从混合物中分离组分的最重要的方法之一。凝胶过滤层析是根据流体分子的体积或分子量不同来达到对蛋白质分离的目的，离子交换色谱层析的固定相为阴离子或者阳离子交换剂，流动相为粗蛋白溶液，根据组分离子与交换剂上的平衡离子的结合力大小而进行分离的一种色谱层析方法。目前，分离纯化AFPs 最常用的方法是凝胶过滤色谱法和离子交换色谱层析法。通常，AFPs 的分离纯化需要这些色谱方法的组合应用。

Ding 等[37]从冷驯化的大麦中提取AFPs，通过超滤浓缩样品至五分之一，硫酸铵梯度沉淀，然后再通过高配基密度-羟色藻糖快速流动层析和凝胶过滤色谱层析两种色谱层析的方法纯化大麦籽粒AFPs，然后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行蛋白鉴定。结果表明，渗透离心提取的蛋白比传统方法更有针对性。Wu等[38]用细胞外蛋白酶对三文鱼皮中的胶原蛋白进行水解，通过超滤和尺寸排阻层析后，得出其水解产物具有良好的抗冻性（>3 kDa）和抗氧化活性（< 3 kDa）。

4.3 Ni 柱亲和层析

Ni 柱亲和层析依据金属Ni 通过与电子供体配基上能与Ni2+相互作用的羧基或氨基的电负性元素（O，N）形成较稳定的金属螯合物，使得AFPs 可以选择性地结合在填料上，而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。用不同浓度的咪唑缓冲液将结合在介质上的His 标签蛋白洗脱下来，由于纯化的重组蛋白粗提取液中含有His-Tag 标签，Ni2+与His-Tag 标签结合，通过Ni 柱亲和层析纯化出需要的蛋白质，可以得到较高纯度的His 标签蛋白。Mao 等[39]在大肠杆菌中异源表达GmAFPIV 蛋白，将蛋白上清粗提取液负载在Ni-NTA 柱上，用不同浓度咪唑缓冲液把目的蛋白洗脱下来，经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，其分子量约为30 kDa，通过蛋白质免疫印迹验证其活性。金泉等[40]通过在大肠杆菌中表达丝胶抗冻肽并用镍琼脂糖亲和层析对其蛋白粗提取液进行纯化，测得其蛋白分子量为25～35 kDa，并证明了提取到的融合蛋白具有抗冷冻胁迫保护作用。表3 总结了3 种AFPs 分离纯化方法的优点与缺点。

表3 AFPs 的分离纯化方法对比Table 3 Comparison on the separation and purification methods of antifreeze proteins

5 AFPs 在食品中的应用

近年来，随着对AFPs 性质和机理的深入研究，其应用领域也越来越广泛。在食品工业中，AFPs 被认为是天然的冰晶生长抑制剂，即使在较低的浓度下，它依然能够在食品的冷冻、储存、运输和解冻过程中抑制冰晶再结晶和降低化合物的冰点，从而通过减少细胞损伤来保留食物原有风味，减少营养物质的损失，延长产品的货架寿命。

5.1 AFPs 在冷冻肉制品中的应用

AFPs 通过不可逆地附着在冰晶表面，抑制冰晶的生长，进而改变冰晶的形态，抑制再结晶，提高冷冻食品的生物抗冻能力。Zeng 等[41]采用响应面法对罗非鱼加工副产物进行酶解，制备了抗冻肽，通过扫描电镜观察发现，与生理盐水组相比，抗冻肽保护下的细胞表面更规则、光滑、完整，表明其可作为一种新型菌体的冷冻保护剂，用于益生菌的保存。Chen 等[42]将不同浓度的AFPs 添加到冷冻鸡肉中，观察鸡肉的持水能力、水分分布、颜色、蛋白质特性、微观结构和组织学的变化，结果表明，AFPs 可以显著提高冷冻鸡肉的品质，减少冷冻期间鸡肉的营养损失，是一种潜在的、安全的、高效的冷冻保护剂。Li 等[43]研究发现，添加0.2%AFPs 的速冻猪肉饼经过5 次冻融循环后，肉饼硬度和弹性均高于对照组。

5.2 AFPs 在冷冻面团中的应用

AFPs 可以改变冰晶的大小和形状，从而抑制冰晶的再结晶，这对提高冷冻食品的品质和延长保质期有重要作用。目前，AFPs 已被应用于许多冷冻食品的加工中。例如，向预烤冷冻面包中添加小麦AFPs 和海藻糖，发现AFPs 能够改善复烤面包的品质，与未添加相比，0.6% AFPs 与0.6%海藻糖能够缓解冻融对复烤面包的影响[44]。Zhang 等[45]研究了添加或不添加AFPs 的情况下对冷冻面团的影响。结构特性结果显示，添加燕麦AFPs 可以降低冷冻面团中的可冻水含量。流变学特性结果表明，与未添加燕麦AFPs 组相比，添加燕麦AFPs 组的发酵能力更强；扫描电镜结果表明，燕麦AFPs 的加入可以保护面筋基质免受温度波动和冷冻造成的破坏，从而使馒头质地特性更好。AFPs 的添加可以改善馒头的质地，但随着存放时间的延长，这种改善作用逐渐减弱。

5.3 AFPs 在冰淇淋中的应用

在冰淇淋产品中，玻璃化转变温度是评价冰淇淋在储存过程中热力学稳定性的一个指标。AFPs 可以提高冰淇淋的重结晶、耐融性和玻璃化转变温度[46]。为了开发一款质地细腻、抑制重结晶能力强的冰淇淋，Kaleda 等[47]将冬黑麦AFPs 添加到冰淇淋中，研究AFPs对冰淇淋结构和质地的影响。结果显示，当AFPs 存在时，冰淇淋中的冰晶明显变小，再结晶受到抑制，冰淇淋质地更顺滑，提高冰淇淋对温度波动的耐受性。Zhang 等[48]从燕麦中提取燕麦抗冻蛋白（Avena sativa L.AFPs，AsAFP），在浓度15.0 mg/mL时，其THA 为1.24 ℃，经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS） 和串联质谱（tandem massspectrometry，MS/MS）质谱分析结果表明，AsAFP与几丁质内质酶同源。随后，将0.1%的AsAFP 添加到冰淇淋中，使得玻璃化转变温度从-29.14 ℃增加到-27.74 ℃，有效提高了冰淇淋的抑制重结晶和耐融化性。

5.4 AFPs 在低温果蔬中的应用

无论是植物细胞还是动物细胞，在冷冻时的细胞损伤都是由再结晶时晶体尺寸的增加导致。此外，AFPs 通过抑制冰晶的生长来防止再结晶，进而阻碍冰的融化[49]。在低温保存过程中，融化或解冻是导致细胞损伤的主要过程。Kashyap 等[16]用沙棘抗冻蛋白（hippophae rhamnoides chitinase class IV，HrCHI4）预处理青豆，然后将其冷冻保存，并对HrCHI4 作为冷冻保护剂的作用进行了分析。通过扫描电镜、气相色谱-质谱等检测青豆的结构和组成成分，结果表明，用HrCHI4 预处理后能够降低冷冻青豆的滴水损失和电解质泄漏，保持了青豆细胞膜的完整性，保护外层细胞并促进冻融后挥发成分的保留。此研究通过自然方法来保持低温蔬菜的质地和新鲜度，开辟了AFPs 在果蔬产品保存中的应用途径。Kashyap 等[50]对豌豆冷冻前进行预处理，测定了冷冻豌豆解冻后的滴水损失，采用高效液相色谱法检测豌豆在冷冻前后维生素的流失情况。结果表明，使用大麦AFPs 处理后的豌豆水分和维生素（硫胺素、吡哆醇、核黄素和抗坏血酸含量）损失减少。

6 展望

目前，由于AFPs 制备成本高昂，因此在食品领域还未得到广泛的应用。

6.1 制备前景展望

除了通过化学法、分子生物学表达、基因工程表达方法制备AFPs，还可以用体外无细胞蛋白合成系统（cell-free translation system，CFPS）来制备AFPs。CFPS是以外源DNA 或者mRNA 为模板，在无细胞蛋白表达体系内补充底物和能源物质[腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）等]，利用细胞抽提物提供的细胞器在T7/SP6 RNA聚合酶的组合下体外表达目的蛋白质的系统。

在CFPS 中，细胞膜的缺失有助于蛋白质折叠，进而更好地合成AFPs 以达到高通量生产，并且CFPS 制备出的杂蛋白少，利于纯化蛋白，从而避免了纯化过程中靶蛋白的减少，可以获得更高的蛋白产量[51]。由于不含有活细胞，因此，CFPS 自然地克服了维持细胞活性的通用限制，在人工和预定义的环境中工程化和控制基本和必要的细胞过程方面具有巨大潜力[52]。

6.2 应用前景展望

生物体的抗寒能力是生物体适应恶劣自然环境的一种能力，AFPs 的出现揭示了这种自我保护能力的本质。随着AFPs 的研究逐年增多，不仅发现了越来越多的耐寒生物体中含有AFPs，而且AFPs 的防冻作用机制也越来越清晰。低温医学是开发安全、高效、适用于重大疾病治疗的医用防冻剂的新兴领域。血液、胚胎、器官，甚至身体等各种相关生物材料都需要冷冻保存，保存后的生物材料可用来帮助患者治疗和恢复身体健康。虽然昆虫AFPs 的抗冻活性高于其他种类的活性，但是无法从昆虫中大量提取AFPs。因此，大多数应用的AFPs 都来自鱼类AFPs，其中III 型AFPs 更容易通过基因重组产生，最常用于低温保存。

7 小结

从AFPs 的特性和应用来看，它不仅与人们的生活息息相关，而且也渗透到各个领域。本文介绍了AFPs 的来源，诸多研究表明，自然界中不同生物来源AFPs 的特征有差异；总结了AFPs 的特性，其具有降低溶液的冰点，保持溶液熔点不发生变化，阻止微小冰晶在冷冻、低温保存过程中生长为大晶体的特性，并具有改变冰晶形态的能力；此外详细描述了目前常用的AFPs 制备与纯化方法，并对这些方法的优缺点进行分析；最后介绍了AFPs 在食品中的应用现状并展望其制备和应用前景。尽管AFPs 作为未来生物技术的重要性在不同领域得到了认可，但对其在低温下的作用和调节抗冻活性机制仍需进一步研究。