基于栅极功能化捕获甲胎蛋白的溶液栅控石墨烯晶体管生物传感器

严会玲,曹磊,邹荣,张修华,王升富,何汉平

(湖北大学化学化工学院,湖北 武汉 430062)

0 引言

甲胎蛋白(AFP)是一种多功能糖蛋白生物标志物(Mw=70 000 Da),可作为治疗和干预中正常生理、致病或药理学反应的预后指标[1-2]。其在健康成人血液中的浓度应小于25 ng/mL,如果人体血液中甲胎蛋白的浓度增加,可能预示着肝癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌以及其他胃肠道癌症的发生[3]。此外,检测孕妇体内的甲胎蛋白含量有助于发现胎儿的先天缺陷和新生儿疾病[4]。通常肝细胞癌(HCC)占肝癌的85～90 %,在死亡病例中因患肝癌死亡占据主要人数[5]。AFP已被广泛接受为肝癌细胞的生物标志物。由此可见,监测人体中AFP浓度对早期病变的诊断以及后期治疗的分析显得尤为重要。近几年AFP的检测技术发展十分迅速,例如酶联免疫吸附法[6](enayme-linked immunosorbent assy,ELISA),化学发光法[7-8]、荧光免疫分析法[9-11](fluoroimmunoassay,FIA)和电化学免疫分析[12-14](electrochemical immunoassay)。这些方法具有高精度、选择性高等优点,但是也存在一定的局限性,包括需要较高的专业要求、耗时的实验过程和标记过程、以及复杂的实验测试底液。例如,ELISA方法不能有效地检测在肿瘤早期低浓度的肿瘤标志物,同时它也需要高技能的技术人员进行实验[15],无法实现普遍化。传统的电化学免疫传感器具有灵敏度低的缺点,虽然可以通过引入各种信号放大来提高灵敏度,例如,滚环扩增(RCA)[16-17]、使用氢供体(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)[18]和酪胺信号放大(TSA)[19],这些技术使诊断过程复杂化。因此,具有灵敏度高、简单操作且高效的手段来检测低浓度的疾病标志物是非常有必要,特别是用于即时检测(POCT)。

无标记型的传感器能够减少繁琐的制备过程,其原理是反应前后的界面电流、电容以及电势等产生变化,从而得到信号输出,但是该检测方法的灵敏度较低,导致不能对低丰度目标物进行检测。晶体管作为一种新型的信号载体,其无需借助复杂的修饰手段对信号进行放大处理就可以得到较好的信号响应,已成功应用在各种类型的生物传感器中[20-23]。溶液栅控场效应晶体管由于其能在电解液中进行测试工作,因此决定了该设备的工作电压要小于1 V[21-22],低电压的工作电位有效地防止了检测液的分解、干扰、保护生物体不被破坏等。液体的工作环境满足了大部分的生物检测分析,为生物分子检测提供了一个可靠的平台。

因此本工作设计了一种无标记电位型溶液栅控石墨烯晶体管生物传感器对甲胎蛋白的检测(图1)。在栅电极上通过电沉积纳米金层来捕获AFP抗体(anti-AFP),牛血清白蛋白(BSA)作为封闭剂,最终分析物AFP被特异性结合到电极上。在pH=7.4的PBS中,生物分子带有一定的电荷,引起栅极/电解质溶液界面电势的变化,从而改变了有效栅压,最终导致转移曲线中狄拉克点的偏移。根据电位偏移量对甲胎蛋白进行定量分析,实现无标记检测。

图1 SGGT的构建过程

1 实验部分

1.1 试剂与仪器PMMA/CVD铜基底单层石墨烯、羧基化多壁碳纳米管购于南京先丰纳米科技有限公司。氯金酸(HAuCl4·3H2O)、癌胚抗原(CEA)购于Sigma-Aldrich公司(北京)。anti-AFP、AFP购于上海领潮生物科技有限公司。20×磷酸盐缓冲溶液购于生工生物工程股份有限公司。碳酸钾(K2CO3)、丙酮(C3H6O)、五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)、盐酸(HCl)均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。人血清白蛋白(HSA)、凝血酶(TB)和肌红蛋白(MB)购于上海源叶生物科技有限公司。30% H2O2、辣根过氧化物酶、牛血清白蛋白(BSA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和柠檬酸钠(C6H5Na3O7)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。金丝、铬购于中诺新材科技有限公司。玻璃基底购于洛阳古玻璃有限公司。

2450数字源表,美国吉时利仪器有限公司。CHI660E电化学工作站,上海辰华仪器有限公司。V22-300热蒸发镀膜仪,北京中科科技股份有限公司。Tecnai G20透射电子显微镜,美国FEI公司。UV-2700紫外可见分光光度计,日本Shimadzu公司。3-18KS冷冻离心机,美国Sigma公司。Milli-Q超纯水仪器,美国Millipore公司。玻碳电极、饱和甘汞电极、银/氯化银电极和铂电极,武汉高仕睿联科技有限公司。

1.2 石墨烯溶液栅场效应晶体管的制备首先对玻璃基底(10×10×0.7 mm)进行清洗处理,将其分别用丙酮、乙醇、H2O超声清洗各30 min,并用N2吹干。并使用7%的氢氟酸进行刻蚀1 min,使用超纯水冲洗干净,并用N2吹干。随后把玻璃基底放置在掩膜板中在热蒸发镀膜仪中进行蒸镀。先蒸镀金属铬作为粘接层,再蒸镀金层作为源漏电极,铬层让金层更好地贴合于玻璃基底上。最终其厚度为5 nm左右铬层,70 nm左右的金层。该器件的沟道长度和宽度分别为6 mm和0.25 mm。将购买的石墨烯裁剪成5×5 mm大小,放入由H2O、HCl和CuSO4·5H2O组成的刻蚀液中(50 mL∶50 mL∶10 g)大约30 min后,铜基底被刻蚀干净,变成透明的PMMA/石墨烯。利用载玻片将PMMA/石墨烯转移到超纯水中清洗三次,再将PMMA/石墨烯覆盖在镀有源漏极的玻璃基底的沟道位置,过夜干燥。最后,把转移好石墨烯的器件浸入丙酮溶液,依次浸泡3 min,5 min,10 min以除去PMMA层,浸泡完成后,用乙醇冲洗器件,再放置在95 ℃的加热台上加热10 min。SGGT石墨烯沟道制备完成,储存在干净的表面皿中。

1.3 栅极的修饰首先将玻碳电极在麂皮上用Al2O3进行抛光,再通过循环伏安法对PBS和铁氰化钾进行扫描(PBS中无杂质峰,铁氰化钾的氧化还原电位差值小于75 mV),分别在水、乙醇、水中超声清洗5 min。然后在底液浓度为0.5 %的HAuCl4·3H2O中,以-0.2 V,60 s的实验条件下进行电沉积。电极在室温下干燥后,取10 μL,50 μg/mL的anti-AFP于电极表面,4 ℃下放置一夜。使用PBS溶液冲洗电极去除多余抗体,电极表面吹干后,滴10 μL,1%BSA封闭电极,室温下放置30 min。最后,电极用PBS清洗3次,吹干电极,滴加10 μL不同浓度的AFP抗体,37 ℃,1.5 h。待测电极浸没在10 mmol/L PBS中保存。

1.4 甲胎蛋白的检测利用两个半导体参数分析仪Keithley 2450联用分析SGGT生物传感器的性能(图1),并且通过LabView程序进行控制。SGGT装置在0.01 mmol/L PBS底液中进行测试。通过半导体参数分析仪,以0.01 V/s的扫描速率得到SGGT的转移曲线(IDS/VGS),在栅极范围在0～1 V,固定的沟道电压为VDS= 0.05 V下工作。采用电化学阻抗谱(EIS)的方式对电极的修饰过程以及电极上anti-AFP最大捕获量进行了测试。EIS在含有0.1 mol/L KCl的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中采用传统的三电极体系(玻碳电极、饱和甘汞电极和铂电极)进行检测。

2 结果与讨论

2.1 实验原理当施加栅压时,溶液栅控场效应晶体管体系具有两个双电层:栅极/电解质溶液(CG-E)和电解质溶液/沟道(CE-C),可以模拟成两个平行板电容器的等效电路,如图2(A)所示。蛋白质由两性离子氨基酸化合物组成,每种蛋白质都具有它们自己的等电点(pI)。当蛋白质处于不同pH值的溶液环境时,它们可以带正电荷或带负电荷。AFP的等电点是4.9,因此在中性的PBS溶液中带负电荷。栅电极的表面电位会受到带电分子的影响,当栅极捕获目标物AFP后,带负电荷的AFP在栅极界面产生电偶极子(在图2(A)蓝色箭头标识的位置),从而改变晶体管的有效栅电压。

图2 (A)双电层中电位降以及偶极子分布图和(B)捕获目标物前后转移曲线的变化

(1)

(2)

ΔQ为捕获目标物后的改变电荷,C为SGGT的总电容。CG-E为栅极/电解质溶液界面电容,CE-C为电解质溶液/沟道界面电容,S活性层的面积。沟道电流IDS的公式如下:

(3)

(4)

式中,VDirac为电中性时的栅极电压,此时的空穴和电子的浓度相等,为最低的电流。电极界面形成的偶极子,诱导电位Δφ可表示为:

(5)

2.2 栅极修饰表征本研究在电化学工作平台上通过EIS研究了栅极界面修饰过程。如图3(A)所示,裸电极的阻抗值为200 Ω,电沉积一层纳米金层时,阻抗值从200 Ω减小到50 Ω,这是因为纳米金能加速电子传递的速度,导致阻抗值减少。当anti-AFP被捕获在电极上时,阻抗值从50 Ω增加到950 Ω,抗体作为电惰性物质,降低了电子的传输速度,导致阻抗值增大(图3(B))。同样,牛血清白蛋白和抗原分子均为非导电生物分子,当牛血清白蛋白进行封闭后,其阻抗值增加到1 163 Ω。修饰栅极捕获目标物AFP后,其阻抗值进一步增加到4 500 Ω。上述分析表明栅极修饰以及对AFP的捕获是成功的。

图3 栅极修饰过程的电化学阻抗图谱

2.3 实验条件优化对纳米金界面捕获抗体的最大量进行了优化来保证足够的检测范围。GCE电沉积纳米金层后,滴加不同浓度的anti-AFP浓度(10 μg/mL,20 μg/mL,30 μg/mL,40 μg/mL,50 μg/mL)到该修饰电极上,于4 ℃下培育12 h,随后通过电化学阻抗法研究最优浓度。如图4(A)所示,当anti-AFP的浓度达到50 μg/mL时,阻抗值的变化值可忽略不计,因此为了保证anti-AFP有足够的量去捕获抗原,选择anti-AFP的浓度为50 μg/mL。

图4 (A)抗体固载量和(B)测试底液PBS浓度的优化(n=3)

对于场效应晶体管,电解质溶液的离子强度对传感器的灵敏度影响很大。在电解质溶液中,由于静电相互作用,带负电荷的抗体分子被阳离子包围,这些表面电荷在双电层的德拜长度(Debye length)内是可以被屏蔽的。因此,与栅极的距离大于Debye长度的蛋白质对栅极电位的影响很小。由此可见,与电解质的离子浓度相关的Debye长度会影响传感器的性能。在电解质溶液中的Debye长度(Debye length)可以由下面的公式定义:

(6)

式中,ε为电解质的绝对介电常数,κ是玻耳兹曼常数,T是温度,NA是阿伏伽德罗常数,I是溶液的离子强度,q是电荷量。为了检测Debye长度对器件性能的影响,分别在不同离子浓度的PBS(20 mmol/L、10 mmol/L、5 mmol/L、1 mmol/L、0.1 mmol/L)中检测同一浓度的AFP(100 ng/mL)。如图4(B),当离子浓度从1 mmol/L开始增加时,栅压的偏移量随着PBS离子浓度的变化有很大的差距,这说明PBS离子浓度超过1 mmol/L时,德拜长度较短,很大程度上影响器件性能变化,不适合该传感的检测分析。然而发现低于1 mmol/L时,栅压偏移量的差距几乎可以忽略,这表明Debye长度的进一步增加将不会再明显影响器件的性能。因此选择测试液PBS的离子浓度为0.1 mmol/L。

2.4 甲胎蛋白检测如上所述,该SGGT对AFP进行检测时,优化了栅极的固载量和电解质溶液的浓度来提高灵敏度。根据检测原理可知,中性电解质环境下,带负电荷的抗原分子,在栅极界面产生偶极子,使栅极界面的电位下降,为了保持有效栅压一致,则需要施加更大的栅压(VDirac向正方向偏移)。因此,栅极上存在不同数量的目标物对栅极界面的电位影响不同,栅压的偏移量也会不同,可根据不同浓度目标物与栅压偏移量之间的关系拟定线性关系。在固定沟道电压(VDS= 0.05 V),栅压范围从0～1 V,测定转移曲线。如图5(A-G)所示,随着目标浓度的增加(5 ng/mL至200 ng/mL),转移曲线偏移量逐渐增加,并且呈现了较好的线性关系ΔVDirac= 45.42lgc+ 4.98(R2= 0.990 1),检测限为1.00 ng/mL(图5(H))。相比于其他的生物传感器,SGGT生物传感器具有高的灵敏度(表1)。

表1 其他AFP免疫传感器的性能比较

图5 (A～F)不同目标物浓度下SGGT的转移曲线测试图,(G)转移曲线测试汇总图和(H)SGGT的线性图

2.5 传感器的选择性与稳定性这里我们选取血液中常见的四种干扰物质凝血酶(TB)、人血清白蛋白(HAS)、肌红蛋白(MB)和癌胚抗原(CEA)对该SGGT传感器选择性进行评估。实验过程中,除了将目标物AFP替换成干扰物质,其他实验条件及步骤均不变,记录下VDirac,其中AFP的实验浓度为10 ng/mL,其他干扰物质的浓度均为50 ng/mL。如图6(A)所示,当存在目标物AFP时,其输出信号远大于干扰物所产生的信号。该结果表明,SGGT对AFP的检测具有较高的选择性。使用同一器件在5天内隔天重复测试同一根电极(目标物浓度为5 ng/mL)来测试器件以及栅极修饰的稳定性。如图6(B)所示,五天内的重复检测结果与初始检测信号相差不大,可忽略不计,实验结果表明了SGGT整体具有较好的稳定性。综上所述,表明该溶液栅控石墨烯晶体管生物传感器对甲胎蛋白的检测具有很高的选择性和稳定性。

图6 (A)SGGT传感器的选择性测试(n=3)和(B)同一个器件连续五天测试的稳定性测试(n=3)

2.6 血清中AFP的加标回收临床样品中AFP目标物的检测是在血清中进行,血清作为一个十分复杂的生理环境,含有很多的酶、蛋白质、激素、无机物等,因此实验中非常有必要验证该传感在血清中是否受到这种复杂生理环境的影响。这里我们使用稀释10倍的人血清作为背景培养液体进行人血清加标实验,其中AFP的浓度分别为5 ng/mL、30 ng/mL、100 ng/mL。如表2可知检测结果准确,回收率在100.6%～108.0%范围内,相对偏差在0.6%～1.3%之间。这些检测结果表明,该SGGT生物传感器可以应用于复杂的血清环境中进行甲胎蛋白的检测。

表2 人血清中对甲胎蛋白的加标回收测试 (n=3)

3 结论

本工作构建了无标记电位型溶液栅控石墨烯晶体管并对甲胎蛋白进行检测。采取简单的抗体功能化栅极捕获目标物,实现了甲胎蛋白的高选择性、高灵敏的分析检测。栅极的成功修饰保证了器件的稳定性,并且器件沟道部分实现了重复利用。研究表明检测液离子浓度会显著影响栅极界面的德拜长度进而影响器件对AFP的检测,发现PBS离子浓度低于1 mmol/L没有明显影响。电位型策略主要是根据转移曲线中性点的偏移量对甲胎蛋白进行定量测试,结果表明在5 ng/mL至200 ng/mL浓度范围内,偏移量与AFP的对数浓度呈现良好的线性关系:ΔVDirac= 45.42lgc+ 4.98(R2= 0.990 1),检测限达到了1.00 ng/mL。综上所述,SGGT生物传感器在免标记的检测方面具有很好的应用前景,同时该方法简单稳定、易于集成化,有望实现高通量检测。