针刺干预对VaD大鼠Caspase-3通路相关蛋白的影响❋

陈 洋,徐子绚,宋 杰△,王 平,毕天威,张晓明,王 非

(1.湖北中医药大学针灸骨伤学院,武汉 430065;2.湖北中医药大学老年医学研究所,武汉 430065;3.武汉市中医医院,武汉 430000)

血管性痴呆(vascular dementia,VaD)是脑血管因素引起的以高级神经认知功能障碍为主的临床综合征,是神经内科的常见病。VaD作为仅次于阿尔茨海默病的痴呆亚型,患者数约占痴呆总数的20%,2019年全球痴呆症患者的护理费用约为1.3万亿美元,到2030年可能上升至1.7万亿美元,给社会造成巨大负担,是当今世界医学界亟待攻克的疾病之一[1-3]。神经炎症异常、细胞自噬和细胞凋亡等造成的神经元损伤或丢失是VaD的主要病理机制,其中凋亡发挥重要作用[4]。半胱天冬酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-3通路是调节细胞凋亡的关键通路,参与包括VaD在内的多种疾病的发展,可能是治疗VaD的靶点之一[5]。多项研究证实针刺对改善VaD症状有积极作用[6-8]。研究表明,电针百会、肾俞等穴位可以通过抑制外周炎性因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18的生成来改善VaD大鼠的认知功能[9]。临床运用合谷和丰隆穴能够改善痴呆患者的认知障碍[10]。本研究从Caspase-3通路的角度观察针刺百会、肾俞、丰隆穴对VaD大鼠学习记忆能力的影响,探究其改善VaD认知功能障碍的可能作用机制,探索针刺防治VaD的新靶点。本研究获得湖北中医药大学动物实验伦理委员会批准,批号:82130119。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级2月龄健康雄性SD大鼠36只,体质量(250±20)g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,许可证号:SCXK(辽)2020-0001,饲养于湖北中医药大学老年医学研究所,大鼠适应性喂养1周,6只/笼,自由摄食、饮水,室温(24±2)℃,湿度恒定,正常昼夜节律采光。

1.2 主要仪器和试剂

包埋机(型号:JB-P5)、冻台(型号:JB-L5),武汉俊杰电子有限公司;台式高速冷冻离心机(型号:D3024R),北京DragonLab公司;高速低温组织研磨仪(型号:KZ-Ⅲ-F)、脱色摇床(型号:TSY-B),武汉Servicebio公司;化学发光仪(型号:6300),上海CLINX公司;病理切片机(型号:RM2016),上海徕卡仪器有限公司;荧光定量PCR仪(型号:Quant Studio 3),美国Thermo Fisher Scientific公司;显微镜(型号:E100),日本Nikon公司;一次性无菌毫针(型号:0.25 mm×25 mm),北京中研太和医疗器械有限公司。

HE染色试剂盒(货号:G1003)、DAB显色剂(货号:G1212)、BCA蛋白检测盒(货号:G2026)、β-actin抗体(货号:GB12001)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体(货号:GB13439)、Caspase-3抗体(货号:GB11532)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗体(货号:GB11690)、山羊抗兔二抗(货号:GB23303)、山羊抗小鼠二抗(货号:GB23301)、RNA提取液(货号:G3013)、逆转录试剂盒(货号:G3330),武汉Servicebio公司。

1.3 分组与造模

36只大鼠按随机数表分为假手术组、模型组和针刺组,每组12只。模型组与针刺组大鼠采用双侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)分次结扎法制备VaD模型。术前12 h内禁食,正常饮水,腹腔注射6%水合氯醛(0.5 mg/100 g)麻醉,将大鼠仰卧固定于鼠台,暴露颈部,备皮,75%酒精消毒,沿大鼠颈部正中线做1 cm切口,暴露和分离左侧CCA,注意避开迷走神经,利用4号手术线分别结扎左侧CCA远心端和近心端,予以0.5 g红霉素软膏混合0.1 g青霉素粉剂涂擦伤口预防感染,术后注意保温。3 d后在相同条件下,对右侧CCA进行同样结扎处理。假手术组仅分次行CCA分离,不予结扎处理。

1.4 模型评价

手术结束1周后,应用Morris水迷宫进行定位航行测试。计算针刺组和模型组大鼠的逃避潜伏期,即大鼠从4个象限入水点爬上目标平台所消耗时间,将4次均值作为参考值。计算大鼠造模后的平均逃避潜伏期与参考值的比值,比值≥120%为造模成功。

1.5 针刺干预

模型评价结束后对针刺组大鼠进行针刺干预。取穴:百会、肾俞(双)、丰隆(双),依据《实验针灸学》[11]定位。百会:向后平刺3～5 mm;肾俞:向后下方斜刺5 mm,与皮肤呈45°;丰隆:直刺3～5 mm。每日针刺1次,每次20 min,干预6 d后休息1 d,共干预2周。其余两组不做处理,模拟同等抓取。

1.6 Morris水迷宫实验

针刺结束后第2天开展,评估大鼠的空间定位及学习记忆能力。定位航行实验:本实验连续开展5 d,先令大鼠于水池中自由游行60 s以适应环境,分别在水池4个象限边缘中点作标记,平台低于水面2 cm,固定于同一象限。将大鼠面向池壁依次从4个标记点放入水中,间隔5 min。设置最长时间为90 s,在此期间内爬上平台的大鼠,记录对应时间并令其在台上停留30 s。对于规定时间内寻找平台失败的大鼠,将其带至平台,同样于平台上熟悉30 s,时间直接记为90 s。以4次时间的均值计算最终结果。空间探索实验:第6天移除池中平台,将大鼠面向池壁从非平台所在的同一象限位置入水,记录其90 s内穿过原平台区域的次数。

1.7 取材与指标检测

1.7.1 处死与取材 行为学实验完成后第2天取材。大鼠采用3%戊巴比妥钠(0.5 mg/100 g)腹腔注射麻醉后断颈处死,取脑,冰面上剥离双侧海马,液氮速冻左侧海马并于-80 ℃保存,用于后续定量PCR及Western blot检测。石蜡切片制备:4%多聚甲醛溶液固定右侧海马体,脱水、透明后置于石蜡中浸泡后包埋,冷却后作5 μm厚度的冠状切片,供后续HE染色及免疫组化检测。

1.7.2 HE染色检测大鼠海马区形态学变化 石蜡切片脱蜡水化后按HE染色试剂盒说明步骤依次苏木精(3 min)、伊红(5 min)染色、脱水、透明,干燥后以中性树胶封闭切片,在400倍光镜下观察大鼠海马CA1区形态并拍照记录。

1.7.3 免疫组化检测海马组织Bcl-2、Caspase-3的阳性表达 组织切片脱蜡水化,用柠檬酸缓冲液(pH 6.0)加热修复,洗涤后与3% H2O2消毒液避光孵育,洗涤、封闭,分别滴加一抗Bcl-2(稀释1∶200)、Caspase-3(稀释1∶500),4 ℃过夜。次日与二抗(稀释1∶200)孵育50 min,洗片后滴加DAB,显色后冲洗,苏木精染核后脱水封片,400倍光镜下观察并收集图像。Image Pro Plus 6.0软件测定图像的平均光密度,并以该值半定量分析蛋白的阳性表达。

1.7.4 Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3的蛋白表达 称取冷冻海马组织匀浆,裂解、离心后测定上清中蛋白浓度,电泳、转膜,TBST冲洗后5%脱脂牛乳封闭30 min。分别滴加一抗Bax(稀释1∶200)、Bcl-2(稀释1∶200)、Caspase-3(稀释1∶500)及β-actin(稀释1∶1 000),4 ℃过夜。次日洗涤后与对应二抗(稀释1∶200)混合后进行2 h孵育,洗膜后暗室显影、定影,Image Pro Plus 6.0软件完成目标条带光密度的测定,以β-actin为内参,分析蛋白的表达水平。

1.7.5 荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表达 取约20 mg的海马组织,与1 mL的RNA提取液匀浆后依次行离心、沉淀、洗涤,于沉淀液中加入约15 μL RNA溶解液,提取海马组织总RNA,测定RNA含量及浓度后,逆转录为cDNA。在cDNA中加入上、下游引物进行定量PCR,以GAPDH为内参。引物扩增序列见表1。最终数据采用2-△△Ct法进行定量。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠空间学习记忆能力比较

与假手术组比较,模型组平均逃避潜伏期显著延长(P<0.01),平均穿台次数明显减少(P<0.01);与模型组比较,针刺组平均逃避潜伏期显著缩短(P<0.01),平均穿台次数明显增多(P<0.01),见表2、表3。

表2 各组大鼠平均逃避潜伏期

表3 各组大鼠平均穿越平台次数

2.2 各组大鼠海马CA1区形态学改变

假手术组大鼠海马神经元排列紧密有序,形态正常,结构完整,核仁清晰。模型组海马区神经元排列无序,细胞间隙增大,轮廓不清,形态不规则,核仁深染固缩,胶质细胞明显增多,神经细胞大量损伤、丢失。与模型组比较,针刺组海马CA1区的病理形态明显改善,细胞排列尚齐,形态较规整,核仁较清楚,胶质细胞减少,见图1。

A.假手术组;B.模型组;C.针刺组图1 各组大鼠海马CA1区形态学改变(HE ×400)

2.3 各组大鼠海马组织Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达水平

根据免疫组化测定Bcl-2及Caspase-3表达的阳性细胞百分比,Western blot测定Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达的相对灰度值,结果显示,与假手术组大鼠比较,模型组海马区Bax、Caspase-3的相对表达增加(P<0.01),Bcl-2的相对表达减少(P<0.01);与模型组比较,针刺组海马区Bax、Caspase-3的相对表达减少(P<0.01),Bcl-2的相对表达增加(P<0.01),见图2、3、4。

注:A.假手术组;B.模型组;C.针刺组;与假手术组比较**P<0.01;与模型组比较##P<0.01;B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2),半胱天冬酶-3(Caspase-3),Bcl-2相关X蛋白(Bax)图4 各组大鼠海马区Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较

2.4 各组大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表达结果

与假手术组比较,模型组海马区Caspase-3和Bax二者mRNA的表达均明显上升(P<0.01),Bcl-2 mRNA的表达下降(P<0.01)。针刺干预后,与模型组比较,针刺组海马区Bcl-2 mRNA的表达明显上升(P<0.01),Caspase-3和Bax mRNA的表达均明显减少(P<0.01),见图5。

注:与假手术组比较**P<0.01;与模型组比较##P<0.01;B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2),半胱天冬酶-3(Caspase-3),Bcl-2相关X蛋白(Bax)图5 各组大鼠海马区Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表达(n=3)

3 讨论

针刺百会穴提高VaD患者认知功能的疗效在多项临床研究中得到证实[6-7],文献研究显示百会穴为针刺治疗VaD及血管相关认知障碍等病的核心腧穴[12-13]。VaD的发病为多种病理因素共同作用的结果,虚实夹杂是其主要病理特点,患者多有肾精亏虚证候[14-15]。肾俞穴为补肾填精的经典穴位,现代研究表明通过电针百会和肾俞穴可提高阿尔茨海默模型大鼠的学习记忆能力[16-17]。VaD属于中医“呆病”范畴,清代著名医家陈士铎认为“痰积于胸中,盘踞于心外,使神明不清,而成呆病矣”(《辨证录·呆病门》),“痰势最盛,呆气最深”(《石室秘录》)。痰浊为“呆病”的重要病理因素。明代《针灸大成》中收录的针灸经典歌赋《玉龙歌》中记载“痰多宜向丰隆寻”,丰隆穴多用于化痰去浊。文献研究显示丰隆穴为高脂血症临床治疗的核心腧穴之一[18],实验证实电针丰隆穴对血脂的多项成分均有良性调节作用[19-20],而血脂异常及其导致的动脉粥样硬化是VaD发生的重要危险因素[21]。

海马体是边缘系统中与空间定位及学习记忆功能关系最为密切的区域[22],对缺血低灌注高度敏感[23]。本研究对大鼠海马组织HE染色显示,模型组海马组织的病理形态与假手术组相比,细胞结构层次紊乱,核固缩深染,胶质细胞增多,神经元大量损伤、丢失,行为学实验显示模型组大鼠穿台次数减少,逃避潜伏期显著延长,空间学习和记忆功能明显障碍,提示海马神经元损伤是VaD认知障碍的可能机制。干预后,针刺组大鼠海马组织的病理改变较模型组明显减轻,空间学习记忆障碍明显改善,说明针刺对于VaD大鼠的脑损伤具有保护作用。

现代研究显示缺血缺氧造成的海马区神经元凋亡与认知障碍密切相关,是VaD重要的病理基础[24]。细胞凋亡是指在各种生理或病理因素刺激下介导的细胞程序性死亡,对于内环境稳态的维持有着重要意义。Bcl-2家族主要参与细胞凋亡中的线粒体途径[25]。Bax和Bcl-2同属Bcl-2家族,二者功能相互拮抗,主要通过调控线粒体外膜的通透性来传递凋亡信号[26]。在正常状态下,Bax和Bcl-2保持相对稳定[27]。在各种生理病理因素的刺激下,分布于线粒体外膜的Bax寡聚并形成线粒体外膜通透孔,进而激活线粒体外膜透性化(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP),促使包括细胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)在内的多种凋亡因子从细胞内释放,引发细胞凋亡[28-29]。与Bax相反,Bcl-2主要通过调节细胞内Ca2+浓度来抑制MOMP,从而发挥抗细胞凋亡的功能[30]。多项研究显示Bcl-2和Bax参与了缺血、缺氧诱发的海马神经元凋亡,二者异常表达激活的细胞凋亡参与了VaD的发展[31-32]。

Caspase家族是执行细胞凋亡的关键酶,受上游凋亡信号的调控,其活化后可启动相关酶的级联反应,介导细胞死亡[33]。凋亡型Caspases可分成启动型和效应型两大类,其中,Caspase-3被认为是关键的效应酶,可在内源性或外源性凋亡启动后被激活,通过切割细胞基质直接导致细胞死亡[34-35]。Caspase-3的表达受通路中上游Bcl-2家族的调控,Bcl-2的过度表达可以显著降低Caspase-3的水平,而Bax可以通过促进Cyt-C等凋亡因子的释放,进一步活化启动者Caspase-9,从而激活Caspase-3诱导细胞死亡[28]。另一方面,Caspase-3又可将Bcl-2裂解成具有类Bax促凋亡活性的功能片段,加快凋亡进程[25]。李曼玲等[36]的研究证实,应用Caspase-3抑制剂可显著降低脑缺血再灌注损伤模型的细胞凋亡水平,而电针足三里、合谷等穴可以发挥与Caspase-3抑制剂相同的作用。高玲等[37]的研究显示抑制Caspase-3的表达可以减轻缺血缺氧诱导的海马神经元凋亡,进而改善VaD大鼠的认知障碍。因此,抑制Caspase-3通路的激活在VaD的防治中有重要意义。

本实验结果显示,Bax和Caspase-3在造模大鼠的海马组织中呈现高表达,抗凋亡蛋白Bcl-2则呈现低表达水平,提示VaD的发病机制可能与Caspase-3通路异常激活介导的海马神经元凋亡相关,与既往研究一致[31,37]。经针刺干预后,大鼠海马区Caspase-3和Bax的表达水平均较模型组显著降低,Bcl-2的表达显著增加,结合行为学实验及HE染色结果分析,针刺百会、肾俞、丰隆穴可能通过促进Bcl-2的表达和抑制Bax的过度表达来拮抗Caspase-3的活化,降低VaD大鼠海马区神经元凋亡水平,减轻海马组织损伤,进而改善大鼠的空间学习记忆功能。

综上所述,针刺百会、肾俞、丰隆穴能提高VaD模型大鼠的学习记忆能力,改善认知功能障碍,其作用机制可能与调节Bcl-2和Bax的表达水平,抑制Caspase-3通路激活介导的海马神经元凋亡相关。