西沙群岛鹦嘴鱼科耳石形态学物种鉴定的可行性研究

康志鹏 李纯厚 李纯然 王 腾 * 赵金发 石 娟 刘 永 *

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所, 农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东珠江口生态系统野外科学观测研究站, 广东省渔业生态环境重点实验室, 广州 510300; 2.西沙岛礁渔业生态系统海南省野外科学观测研究站/海南省深远海渔业资源高效利用与加工重点实验室/三亚热带水产研究院, 三亚 572018; 3.华中农业大学, 武汉 430070)

耳石是存在于鱼类内耳中的钙质沉积体, 主要矿物成分是碳酸钙, 分为矢耳石(Sagittae)、微耳石(Lapillus)和星耳石(Asteriscus)共3对[1]。耳石具有相对稳定的形态、大小结构特征, 其形态具有物种的特异性, 且在一个物种内变化差异较小[2], 因此被广泛应用于物种鉴定和种群识别。

耳石形态主要分析方法有传统形态测量法(Traditional morphometry)、框架测量法(Truss network)等传统几何测量法, 椭圆傅里叶分析法(Elliptic Fourier analysis)、小波变换(Wavelet transform)、地标点法(Landmark method)等耳石轮廓测量法。在应用耳石形态进行物种的鉴别分析时, 选择的方法不同, 会显著地影响鉴别结果。目前, 使用得最为普遍的两种方法为传统形态测量法和椭圆傅里叶分析法。传统形态测量法已被应用于银鲈科(Gerreidae)[3]、马鲛属(Scomberomorus)[4]等的鉴 别研究中; 傅里叶形态分析法已经成功地对圆鲹属(Decapterus)[5]等进行物种鉴别; 传统形态测量法结合椭圆傅里叶形态分析法, 已经应用在欧白鱼属(Alburnus)[6]、平鲉属(Sebastes)[7]、雪冰鱼属(Chionodraco)[8]等的鉴别中。

鹦嘴鱼科(Scaridae)隶属于鲈形目(Perciformes)隆头鱼亚目(Labroidei), 有10属99种, 主要栖息在珊瑚礁海域[9]。由于其能够啃食藻类而为珊瑚提供珊瑚礁石上的附着基质, 因此被认为是珊瑚礁的保护生物[10]。鹦嘴鱼颜色各异, 种类繁多, 且个体从雌性转变为雄性、幼鱼成长为成鱼时鹦嘴鱼的体色也会随之改变[11], 容易鉴别为其他种, 此时形态稳定的耳石便可作为分类的辅助材料。目前为止, 关于鹦嘴鱼的研究主要集中在基础生物学[12]、时空分布[13]和行为特征[14]等方面, 有关鹦嘴鱼耳石形态方面的研究较少, 且仅仅停留在文字描述和尺寸参数的研究上[15,16], 在鹦嘴鱼物种间形态差异分析方面尚未进行深入的研究。鉴于此, 本研究以西沙群岛4属15种鹦嘴鱼为研究对象, 旨在探究基于耳石形态鉴别鹦嘴鱼种类的可行性, 结果可为鹦嘴鱼的传统形态分类提供佐证和辅助材料; 比较不同耳石形态测量方法对判别结果的影响, 尝试找出适合鹦嘴鱼耳石形态分类的研究方法; 并探究耳石形态是否具有遗传的特性。本研究以期为今后西沙群岛鹦嘴鱼的基础研究提供科学资料, 为鹦嘴鱼资源的保护与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用鹦嘴鱼样本为2018—2021年采自七连屿(16°55′—17°00′N, 112°12′—112°21′E)、永兴岛(16°50′N, 112°20′E)、东岛(16°40′N, 112°44′E)、晋卿岛(16°27′51″N, 111°44′17″E)、羚羊礁(16°28′N,111°35′E)、全富岛(16°32′N, 111°40′E)和银屿(16°35′03″N, 111°42′19″E)等西沙群岛海域。采集到4属15种鹦嘴鱼(表1), 共计1469尾。将采集到的鹦嘴鱼样本冷冻保存, 随后统一将全部样品运回实验室。在实验室解冻后立刻鉴定种类, 然后测量体长(精确到1 mm)、体重(精确到0.01 g; 表1), 摘取左、右矢耳石(下文皆简称为耳石), 清水洗涤后装入离心管储存。

表1 鹦嘴鱼样本的体长、体重数据Tab.1 Body length and weight of Parrotfish

1.2 样品的处理

耳石均用PS-30A超声波清洗机(洁康, 东莞)进行清洗后置于101-3QB电热鼓风干燥箱(明途, 长葛)中50℃干燥12h以上至恒重, 干燥后的耳石使用JJ124BC精密电子天平(G&G, 常熟)进行称重, 精确至0.0001 g。取耳石近轴面(主凹槽所在面)作为分析面, 耳石的凸面朝上, 水平摆放于解剖镜下拍摄整体形态, 拍摄时要尽量使耳石摆放的方向一致,减少人为误差(图1)。同时在图像上标注比例尺,便于后续测量。实验过程中采用LEICA S9D体式显微镜(Leika, Germany)、LEICA MC170 HD显微镜 摄 像 头(Leika, Germany)和LAS图 像 采 集 系 统(Leika, Germany)进行耳石图像采集。本研究使用的鹦嘴鱼耳石均按照图1的标准进行摆放和拍照(图2)。

图1 青点鹦嘴鱼左耳石测量示意图Fig.1 Schematic diagram of Scarus ghobban’s left otolith measurement

图2 本研究所用鹦嘴鱼左矢耳石标本Fig.2 The left sagittal otolith of parrotfish

采集到耳石图像后使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(Media Cybernetics, USA)对其进行测量,长度数值精确到0.01 mm, 面积数值精确到0.01 mm2。本研究选取了19个耳石形态指标如下(表2), 耳石重量对于生长速度的变化最为敏感, 是一个重要的物种鉴别因素[17], 因此, 本研究将其加入耳石形态表征性参数。耳石的可量形状参考已有的研究[18—20]。

表2 尺寸参数和形状指标Tab.2 Sizel parameters and morphological indices of otolith

椭圆傅里叶描述子(Elliptic Fourier descriptors,EFDs)能够描述闭合二维轮廓的任何形状[5]。使用SHAPE 1.3软件包[21]内的ChainCoder程序从耳石图像提取耳石的整体轮廓, 将提取到的信息储存为链码, 运行CHC2NEF程序通过耳石的整体轮廓链码的离散傅里叶变换将轮廓链码标准化为傅里叶谐值。研究表明, 随着傅里叶谐值的增加, 耳石外部轮廓的描述越充分[22]。

由于前10—20组傅里叶谐值能够描述耳石的主要外形轮廓[23]。本研究使用前20组傅里叶谐值进行分析, 每一组谐值由4个变量(an、bn、cn和dn)组成, 故每个耳石的形态由80个椭圆傅里叶系数描述组成, 由于标准化过程中将耳石的前三个系数转变为固定值(a1=1, b1=c1=0), 因此研究中采用77个椭圆傅里叶系数(a2—20, b2—20, c2—20, d1—20)进行统计分析。

对左、右耳石的重量和9个原始形态指标进行t检验, 结果显示灰鹦嘴鱼的左、右耳石在这些测量指标上均无显著性差异(P＞0.05; 表3)。因此, 统一使用左耳石进行本研究中鹦嘴鱼的耳石形态研究。

表3 灰鹦嘴鱼左右耳石差异性比较Tab.3 T-test for the left and right sagittae of Chlorurus sordidus

1.3 数据处理

为了降低体长对分析结果的干扰, 先将体长、耳石形态指标和椭圆傅里叶系数做[lg(x+1.1)]转换,以提高数据分析的准确性[24]。对选取的19个耳石形态指标和77个椭圆傅里叶系数进行正态性和方差齐性检验, 保留符合条件的变量进行下一步的分析; 若数据不满足条件, 则进行Kruskal-Wallis非参数检验, 检验各参数在不同物种间的差异性, 保留差异性显著(P＜0.05)的形态变量用于分析。由于鱼类个体生长速率会对鱼类耳石形态产生影响, 在做判别分析之前应去除鱼类异速生长(Allometric growth)对判别结果造成的偏差[25], 对用于分析的变量进行异速生长校正[26]:

式中,为耳石样品的平均体长。公式(1)表示两个形态变量回归关系的一般形式, 公式(2)表示数据经过对数转换后带误差项的线性关系, 公式(3)表示将任一个观察值 (X i，Yi)转换成一个理论值 (*)。将所用到的已经对数据转化的变量数据按照公式(2)进行回归分析, 求出参数b, 再按照公式(3)求出每一个变量的转换值。

本研究以42尾灰鹦嘴鱼为例, 对其左、右耳石各原始形态学指标及重量进行独立样本t检验, 检验鹦嘴鱼种内左、右耳石的差异性。显著性水平取α=0.05。分别采用3种方式对15种鹦嘴鱼进行判别分析: (1)仅使用19个耳石形态指标; (2)仅使用77个椭圆傅里叶系数; (3)结合19个耳石形态指标和77个椭圆傅里叶系数。对3种方式的交叉检验(Cross-validation)结果进行比较。除此之外, 还结合2种参数在鹦嘴鱼的属的层面进行判别分析, 并且对15种鹦嘴鱼的耳石形态指标和椭圆傅里叶系数的平均值在物种和属的层面上进行聚类分析。判别分析使用Fisher逐步判别法, 聚类分析使用欧氏距离系统聚类法, 数据分析使用SPSS 27.0 (IBM,USA)和Excel 2019 (Microsoft, USA)软件完成。综合判别率(%) =(判别正确个体数/总个体数)×100%。

2 结果

2.1 鹦嘴鱼种层面的耳石形态判别分析

分别采用3种方式对15种鹦嘴鱼进行判别分析,交叉验证结果如表4所示。

仅使用19个耳石形态指标, 15种鹦嘴鱼判别率为33.3%—83.3%, 综合判别率为56.8%, 其中判别率最高的是星眼绚鹦嘴鱼, 为94.9%; 判别率最低的是截尾鹦嘴鱼和网纹鹦嘴鱼, 均为33.3%。仅使用77个椭圆傅里叶系数, 15种鹦嘴鱼判别率为36.4%—83.3%, 综合判别率为63.1%, 其中判别率最高的是小鼻绿鹦嘴鱼, 为83.3%, 判别率最低的是钝头鹦嘴鱼, 为36.4%。结合19个耳石形态指标和77个椭圆傅里叶系数, 15种鹦嘴鱼判别率为43.3%—100%, 综合判别率为75.7%, 其中判别率最高的是星眼绚鹦嘴鱼, 为100%, 判别率最低的是截尾鹦嘴鱼, 为43.3%。

综上, 椭圆傅里叶系数分析鹦嘴鱼物种的综合判别率高于耳石形态指标; 结合耳石形态指标和椭圆傅里叶系数的鹦嘴鱼物种综合判别率高于单独使用其中一种参数。因此, 下文中统一使用耳石形态指标结合椭圆傅里叶系数进行鹦嘴鱼的鉴别研究。

结合耳石形态指标和椭圆傅里叶系数对15种鹦嘴鱼耳石形态的判别结果见表5。星眼绚鹦嘴鱼的判别率最高, 为100%; 灰鹦嘴鱼的判别率为76.2%, 剩余的个体误判为小鼻绿鹦嘴鱼和鹦嘴鱼属内的9个物种; 小鼻绿鹦嘴鱼的判别率为79.2%,12.5%的个体判为同属的灰鹦嘴鱼, 剩余8.3%判为黑鹦嘴鱼; 长头马鹦嘴鱼的判别率为87.0%, 2.7%的个体判为绿鹦嘴鱼属内的2个物种, 剩余10.3%的个体判为鹦嘴鱼属内的7个物种; 鹦嘴鱼属内11个物种的判别率为43.3%—92.3%, 青点鹦嘴鱼的判别率最高, 为92.3%, 只有7.7%的个体判为黄鞍鹦嘴鱼;截尾鹦嘴鱼的判别率最低, 为43.3%, 剩余个体20.0%判为黑斑鹦嘴鱼, 13.3%判为弧带鹦嘴鱼、6.7%判为绿唇鹦嘴鱼, 判为长头马鹦嘴鱼、钝头鹦嘴鱼、黄鞍鹦嘴鱼、网纹鹦嘴鱼、许氏鹦嘴鱼各3.3%; 其余鹦嘴鱼属内的鹦嘴鱼误判成的物种, 大部分为同属内的其他物种或者绿鹦嘴鱼属内的物种, 极少数为星眼绚鹦嘴鱼和长头马鹦嘴鱼。

表5 15种鹦嘴鱼的耳石形态判别结果Tab.5 Results of otolith morphological discrimination of 15 species of parrotfish

2.2 鹦嘴鱼属层面的判别结果

结合19个耳石形态指标和77个椭圆傅里叶系数, 在鹦嘴鱼属的层面进行判别。结果表明, 鹦嘴鱼4个属的判别率为86.5%—100%, 综合判别率为88.6%, 其中判别率最高的是绚鹦嘴鱼属, 为100%,判别率最低的是绿鹦嘴鱼属, 为86.5% (表6); 判别函数一能够解释52.8%的种间差异, 可以有效地将马鹦嘴鱼属和鹦嘴鱼其他3个属区分开; 判别函数二能够解释26.2%的种间差异, 能够有效地将绚鹦嘴鱼属和绿鹦嘴鱼属、马鹦嘴鱼属区分开(图3),对判别函数一作用最大的参数为椭圆傅里叶系数c3, 对判别函数二作用最大的参数为半径比。

图3 鹦嘴鱼4个属的耳石形态判别结果散点图Fig.3 Scatterplot of otolith morphological discrimination results of four parrotfish genera

表6 鹦嘴鱼4个属的耳石形态判别结果Tab.6 Results of otolith morphological discrimination of four parrotfish genera

2.3 鹦嘴鱼种属层面的耳石形态聚类分析

根据19个耳石形态指标和77个椭圆傅里叶系数, 分别在物种和属的层面对15种鹦嘴鱼进行聚类分析。结果表明, 在物种的层面上, 鹦嘴鱼属内的9个物种和灰鹦嘴鱼聚为一支, 再与长头马鹦嘴鱼聚为一支, 鹦嘴鱼属内的2个物种和小鼻绿鹦嘴鱼聚为一支, 这两支聚为一支后再与星眼绚鹦嘴鱼聚类到一起(图4); 在属的层面上, 绿鹦嘴鱼属和鹦嘴鱼属聚为一支, 再与马鹦嘴鱼聚为一支, 最后与绚鹦嘴鱼属聚类到一起(图5)。

图5 基于耳石形态的鹦嘴鱼4个属的聚类分析图Fig.5 Cluster analysis of four genera of parrotfish based on otolith morphology

3 讨论

3.1 不同方法的物种识别比较

本研究结果表明结合耳石形态指标和椭圆傅里叶系数对鹦嘴鱼的物种鉴别效果最好, 其次是椭圆傅里叶系数, 耳石形态指标最差。耳石的体积较小, 且形态多样, 传统形态测量法在耳石形态信息的获取上存在一定的局限性, 只能在一定的程度上反映鱼类生长的相关信息, 对耳石的形态轮廓不能进行准确的描述[27]; 而椭圆傅里叶分析方法可以消除因耳石位置、人工测量产生的误差[28], 对耳石整体形态重建的效果较好, 可以较为清晰地辨别物种之间的形态差异[5]。所以, 相较于耳石形态指标, 使用椭圆傅里叶系数对鹦嘴鱼物种的整体识别效果更好, 这与魏联等[29]的研究结果一致。将耳石形态指标和椭圆傅里叶系数结合起来, 可以识别出耳石形态中微小但很重要的差异[8], 因此, 相比单独使用其中一种参数, 结合两种参数的鉴定效果更好。这与多数研究结果一致, 如鰕虎鱼(Ponticola)[30]、欧白鱼属[6]、平鲉属[7]等的种类鉴别结果均显示是两种参数结合鉴定的效果最好。

3.2 耳石形态判别分析

本研究中鹦嘴鱼物种综合判别率为75.7%, 属综合判别率为88.6%, 低于Bani等[30]研究的94.7%、Bostanci等[6]研究的93.8%, 高于La Mesa等研究[8]的63%。其中, 绚鹦嘴鱼属(星眼绚鹦嘴鱼)和马鹦嘴鱼属(长头马鹦嘴鱼)的判别率较高, 绿鹦嘴鱼属与鹦嘴鱼属的判别率相对较低。原因可能是(1)耳石在生长过程中并非均匀生长, 同一种鱼类中由于个体的生长速率不同可能会存在耳石形态的差异[31]。在相近体长鱼类的耳石形态参数选择及识别过程中, 体长校正能有效降低鱼类个体差异对耳石形态分析结果造成的偏差, 但对于体长差异较大的鱼类,由于耳石形态特征通常会随发育阶段产生变化, 体长校正这一功能是否有效尚不明确[24]。本研究虽然对选择的耳石形态参数进行了异速生长校正, 但部分鹦嘴鱼物种样本体长范围分布较广, 可能会对判别结果产生一定的影响, 因此导致某些种类判别率偏低。(2)星眼绚鹦嘴鱼和长头马鹦嘴鱼耳石相较其他种类耳石的形状特殊。星眼绚鹦嘴鱼耳石前端两侧有较大缺刻, 长头马鹦嘴鱼的耳石为椭圆形且前部钝圆, 这些特征使得它们的耳石在形态识别上更有优势。绿鹦嘴鱼属(小鼻绿鹦嘴鱼和灰鹦嘴鱼)耳石均为卵圆形且前部较尖, 这与鹦嘴鱼属中黑鹦嘴鱼、弧带鹦嘴鱼、绿唇鹦嘴鱼、网纹鹦嘴鱼、许氏鹦嘴鱼和棕吻鹦嘴鱼耳石特征相似, 因此物种相互之间容易造成误判; 黑斑鹦嘴鱼、黄鞍鹦嘴鱼、截尾鹦嘴鱼和青点鹦嘴鱼耳石为梭形且前部较尖, 物种相互之间容易造成误判。结合耳石形态指标和椭圆傅里叶系数可以对耳石形态差异较大的鹦嘴鱼物种进行较好地识别, 但是对于具有相似耳石形态的物种, 形态识别的效果则会降低。(3)在对鹦嘴鱼种类进行判别的过程中, 会舍弃无效或者对判别贡献率小的参数, 从而保留有效参数来进行种类的识别[32]。尽管这种方式保证了参数的有效性, 但也会导致某些耳石形态的缺失, 可能会潜在地造成判别率较低的结果。

3.3 耳石形态聚类分析

鹦嘴鱼属层面的耳石形态聚类分析结果与已有研究[33—36]的鹦嘴鱼分子聚类结果一致: 在属的层面, 鹦嘴鱼属与绿鹦嘴鱼属之间的进化距离最小,亲属关系最近, 其次是马鹦嘴鱼属, 绚鹦嘴鱼属最远, 这说明15种鹦嘴鱼的耳石形态具有遗传的属性;而在物种层面, 本研究结果则与分子聚类结果略有差异。研究表明, 鱼类耳石形态是内在和外在因素之间复杂交互的结果, 其中遗传因素为内在因素,占主导作用[37], 环境[38]、摄食[39]等为外在因素, 起次要作用, 对耳石的表观形态会有一定影响。因此推测, 这些外在因素的影响可能是导致鹦嘴鱼种层面的耳石形态聚类结果与分子聚类结果存在差异的原因。

4 结论

鹦嘴鱼种类繁多, 鱼体形态和颜色多样[34], 这会对其分类鉴定造成一定的干扰, 此时形态稳定性较好的耳石便可作为物种鉴定的辅助手段。当样品保存不当或缺少其他重要分类特征时, 耳石就成为其分类鉴定的关键材料。在一些沉积物和鱼食类动物胃含物的调查中, 耳石是唯一可以鉴定种类的实验材料[40]。同时, 相较于分子生物学方法, 耳石形态方法具有方便、快捷和成本低廉等优势[41]。基于耳石形态学已经对欧白鱼属[6]、鲭属(Scomber)[41]、方头鱼属(Branchiostegus)[42]等进行种类鉴别, 且效果良好。本文研究结果表明, 结合耳石形态指标和椭圆傅里叶系数是进行鹦嘴鱼种类鉴定可行且有效的手段。

鱼类耳石形态研究的准确度需要利用先进的计算机软件技术实现, 耳石是一个三维的立体材料,基于三维立体的研究能够更为全面地提取耳石的形态参数, 更加全面地展现耳石多维结构特征, 从而更好地区分鱼类物种或类群, 进一步提高鱼类物种鉴定的成功率, 这对渔业基础生物学的研究和渔业资源的管理具有重要的意义。