重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株）对蛋鸡免疫抗体监测试验研究

孙心，李丽，李叔伟

（1.哈药集团生物疫苗有限公司 哈尔滨 150040；2.辽宁省盘锦市检验检测中心 辽宁盘锦 124000；3.齐齐哈尔大学 黑龙江齐齐哈尔 161000）

1 材料

1.1 疫苗及试剂

重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗(H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株)，哈药集团生物疫苗有限公司生产。

抗体监测试剂禽流感H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株以及H7N9 Re-4株抗原及阳性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；1%红细胞悬液，哈药集团生物疫苗有限公司质量管理部提供，为SPF 级公鸡红细胞。

禽流感H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株以及H7N9 Re-4株抗原及阳性血清，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；红细胞悬液（SPF 级公鸡红细胞），由哈药集团生物疫苗有限公司提供。

1.2 试验鸡群

15日龄海兰白蛋鸡3 300 只，黑龙江省哈尔滨市某蛋鸡养殖场提供，其中正常免疫鸡群3 000 只，应激试验用300 只。

禽流感H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株以及H7N9 Re-4株抗原及阳性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；红细胞悬液（SPF 级公鸡红细胞），购自哈药集团生物疫苗有限公司提供。

2 方法

2.1 免疫剂量及方法

首免：15日龄，免疫剂量0.3 mL/羽，颈部皮下注射。二免：45日龄，免疫剂量0.5 mL/羽，肌肉注射。三免：75日龄，免疫剂量0.5 mL/羽，肌肉注射。四免：100日龄，免疫剂量0.5mL/羽，肌肉注射。

分为四组，A 组鸡群只接种一次，首免：15日龄，免疫剂量0.3 mL/羽，颈部皮下注射；B 组鸡群接种两次，首免：15日龄，免疫剂量0.3 mL/羽，颈部皮下注射。二免：45日龄，免疫剂量0.5 mL/羽，肌肉注射。C 组鸡群免疫三次，首免：15日龄，免疫剂量0.3 mL/羽，颈部皮下注射。二免：45日龄，免疫剂量0.5 mL/羽，肌肉注射。三免：75日龄，免疫剂量0.5 mL/羽，肌肉注射。D 组鸡群免疫四次，首免：15日龄，免疫剂量0.3 mL/羽，颈部皮下注射。二免：45日龄，免疫剂量0.5 mL/羽，肌肉注射。三免：75日龄，免疫剂量0.5 mL/羽，肌肉注射。四免：100日龄，免疫剂量0.5 mL/羽，肌肉注射。

2.2 血样采集

15日龄免疫前先测定基础抗体，然后于29日龄（首免后2周）、36日龄（首免后3 周）、43日龄（首免后4 周）、52日龄（二免后1 周）、59日龄（二免后2 周）、66日龄（二免后3 周) 、73日龄（二免后4 周）、82日龄（三免后1 周）89日龄（三免后2 周）、97日龄（三免后3 周）、104日龄（三免后4 周）、111日龄（三免后5 周）、118日龄、148日龄、178日龄、208日龄、238日龄、268日龄、298日龄，每次分别每组采集10 份血样，离心制备血清并按照国家标准红细胞血凝抑制试验（HI）进行抗体检测，各组别采血日龄见表1。

表1 各组别采血日龄

2.3 检测试剂和检测方法

各组随机取20 只鸡翅静脉采血，离心制备血清，按照现行《中国兽药典》附录红细胞血凝抑制试验（HI）进行抗体效价检测。待检血清HI 抗体效价≥4 为抗体合格。

2.4 应激试验

300 只鸡分为五组，每组60 只，A 组（15日龄接种0.3 mL/羽）；B 组（15日龄接种0.5 mL/羽）；C 组（75日龄接种0.5 mL/羽）；D 组（75日龄接种0.8 mL/羽）；F 组（75日龄接种1 mL/羽）。接种后通过吸收时间，精神状态，采食量观察不同剂量H5+H7亚型三价灭活疫苗对鸡群的应激情况。

3 试验结果

3.1 重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗接种后的抗体消长规律

1）鸡群免疫一次重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗检测试验鸡不同日龄的抗体效价，结果见表2 和图1。

图1 一次免疫重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗各毒株抗体消长规律

表2 试验鸡群免疫一次重组禽流感三价灭活疫苗后各日龄的抗体效价（lb）

15日龄海兰白蛋鸡接种0.3 mL/羽H5+H7亚型三价灭活疫苗，监测结果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗体效价在29日龄分别是5.2、5.3 和5.3 lb，在52日龄抗体值达到最高值，分别是8.8、8.9 和8.7 lb，73日龄开始抗体值开始逐步下降，分别是7.8 、7.7 和7.5 lb，从结果看三价灭活疫苗15日龄免疫一次，可有效保护到蛋鸡73日龄，不能有效地保证蛋鸡开产前H5+H7亚型三价灭活疫苗抗体水平在6 lb 以上。

2）鸡群免疫两次重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗。

检测试验鸡不同日龄的抗体效价，结果见表3 和图2。

图2 二次免疫重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗各毒株抗体消长规律

表3 试验鸡群免疫一次重组禽流感三价灭活疫苗后各日龄的抗体效价（lb）

15 和45日龄海兰白蛋鸡分别接种0.3 mL/羽和0.5 mL/羽H5+H7亚型三价灭活疫苗，监测结果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗体效价在29日龄分别是5.2、5.3 和5.3 lb，在73日龄抗体值达到最高值分别是9.4、9.2 和9.3 lb，97日龄开始抗体值开始逐步下降，分别是8.9、8.9 和8.7 lb，在蛋鸡开产前118日龄时抗体值分别是7.0、7.0 和6.9 lb，从结果看三价灭活疫苗15 和45日龄免疫二次，可有效保护到蛋鸡118日龄，能有效地保证蛋鸡开产前H5+H7亚型三价灭活疫苗抗体水平在6 lb 以上。

3）鸡群免疫三次重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗

检测试验鸡不同日龄的抗体效价，结果见表4 和图3。

图3 三次免疫重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗各毒株抗体消长规律

表4 试验鸡群免疫三次重组禽流感三价灭活疫苗后各日龄的抗体效价（lb）

15、45 和75日龄海兰白蛋鸡分别接种0.3、0.5 和0.5 mL/羽H5+H7亚型三价灭活疫苗，监测结果H5N6 Re-13株、H5N8Re-14株、H7N9 Re-4株抗体效价在29日龄分别是5.4、5.3 和5.3 lb，在73日龄抗体值达到最高值，分别是9.4、9.2 和9.3 lb，118日龄开始抗体值开始逐步下降，分别是8.9、9.2 和9.2 lb，在蛋鸡开产后208日龄时抗体值分别是6.5、6.6 和6.3 lb，从结果看三价灭活疫苗15日龄、45日龄、75日龄免疫三次，可有效保护到蛋鸡208日龄，能有效的保证蛋鸡开产前和开产后前期H5+H7亚型三价灭活疫苗抗体水平在6 lb 以上。

4）鸡群免疫四次重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗

检测试验鸡不同日龄的抗体效价，结果见表5 和图4。

图4 四次免疫重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗各毒株抗体消长规律

15、45 和75日龄、100日龄海兰白蛋鸡分别接种0.3、0.5、0.5和0.5 mL/羽H5+H7亚型三价灭活疫苗，监测结果H5N6Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗体效价在29日龄分别是5.4、5.3和5.3 lb，在73日龄抗体值达到最高值，分别是9.4、9.2 和9.3 lb，208日龄开始抗体值开始逐步下降，分别是9.1、9.0 和8.9 lb，在蛋鸡开产后298日龄时抗体值，分别是6.9、7.0 和6.9 lb，从结果看三价灭活疫苗15、45 和75日龄、100日龄免疫四次，可有效保护到蛋鸡298日龄，能有效的保证蛋鸡开产前和产后高峰期H5+H7亚型三价灭活疫苗抗体水平在6 lb 以上。

3.2 不同日龄海兰白蛋鸡接种重组禽流感H5+H7亚型三价灭活疫苗的应激反应

试验鸡应激反应情况见表6。

表6 不同日龄海兰白蛋鸡接种重组禽流感H5+H7亚型三价灭活疫苗的应激反应

不同日龄的鸡群接种不同剂量的重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5 N1 Re-13株、Re-14株+H7N9 Re-4），从完全吸收时间、精神状态、采食量方面来评价接种疫苗后对鸡群应激状况的影响，接种最大剂量1 mL/羽时，疫苗对鸡群应激影响是一过性的，2～3 d 可以恢复。那么由于是临床上饲养的蛋鸡群，饲养管理，温度，湿度等都会对鸡群造成一定的影响，还有就是疫苗回温对应激的影响也是存在的，建议疫苗回温时间1～1.5 h。

4 结论

4.1 免疫次数选择

对于蛋鸡开产前免疫重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗次数，从试验结果得出结论，两次免疫只能对蛋鸡开产前有较好的保护作用，不能对蛋鸡开产后产生较好的保护作用，而三次免疫虽然能对蛋鸡开产后产生较好的保护力，但是保护时间较短，能保护到208日龄作用，不能保护蛋鸡开产高峰期，而蛋鸡四次免疫，不仅能有效的保护蛋鸡开产前而且还能很好地对蛋鸡开产后的产蛋高峰期有较好的保护作用，这样在蛋鸡开产后，尤其是在产蛋高峰期期间尽可能不对高产蛋鸡接种重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗，可以减少灭活疫苗对产蛋高峰期蛋鸡产生的应激，尽量不影响蛋鸡高峰期的产蛋率。在蛋鸡饲养过程中，会受到养殖环境、饲料、饮水、疫苗接种时间、疫病流行情况等因素的影响，所以会对蛋鸡接种重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗产生的抗体产生一定的影响，所以，要尽可能结合实验室对蛋鸡抗体值检测的具体结果，来制定对蛋鸡加强免疫重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗的时间，这样可以使蛋鸡在整个生长和生产期都有较好的抗体值，减少鸡群高致病性禽流感的发生。

4.2 疫苗安全性试验

养殖户往往对禽流感疫苗的应激反应有所顾忌，尤其是在蛋鸡开产后担心加强接种高致病性禽流感疫苗会影响蛋鸡的产蛋率，本试验通过安全性试验和对不同日龄蛋鸡接种高致病性禽流感疫苗应激反应观察鸡群状态，没有异常，说明重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗对鸡群没有应激作用，安全性高。■