化学发光法检测EB VCA 和EB EA IgA 的方法学性能评价

李蔼文，王楠，邓超

广东省第二中医院检验科，广东广州 510095

EB 病毒（epstein-barr virus, EBV）是一种能普遍感染人类且与多种恶性肿瘤发病有密切关系的DNA 病毒[1]。EB 病毒编码多种结构抗原，机体感染EB 病毒后针对不同的抗原产生相应的抗体[2]。在鼻咽癌患者的感染早期，EB 病毒衣壳抗原抗体（EB VCA IgA）和EB 病毒早期抗原抗体（EB EAIgA）滴度明显高于健康携带者，检测系统在应用于临床之前须对其性能进行方法学验证。本研究收集2020 年4—6 月到中山大学附属肿瘤医院就诊的患者和体检人群的全血标本，共计40 例。通过MAGLUMI X8 检测系统测定EB VCA 和EB EA IgA的精密度、敏感性与特异性、方法学效果比对、线性范围和参考区间，以验证厂商给定的性能参数，为临床用于鼻咽癌的早期筛查提供快速、准确、可靠的依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集本院就诊的患者和体检人群的全血标本，分为即鼻咽癌（nasopharyngeal cancer, NPC）组（经病理诊断确诊的鼻咽癌患者20 例）和健康对照组（healthycontrol, HC）（健康体检人群20 例），共计40例样本。其中鼻咽癌组中男10 例，女10 例；年龄20～55 岁，平均（33.21±2.44）岁。健康对照组中男9例，女11 例；年龄20～54 岁，平均（33.19±2.42）岁。其中女性排除月经和妊娠，所有标本均无溶血、黄疸、脂浊。

1.2 仪器与试剂

新产业MAGLUMI X8 全自动化学发光仪，EB VCA IgA 试剂（试剂批号：0861900401）、EB EA IgA检测试剂（试剂批号：0901900201）。

1.3 方法

1.3.1 精密度 按照CLSI EP15-A2 文件要求[3]，选择新产业公司配套的高、低值不同浓度的质控品（EB VCA IgA 质控品低值、高值批号分别为：0861900401Q1、0861900401Q2；EB EA IgA 质控品低值、高值批号分别为0901900201Q1、0901900201Q2）作为精密度评价的样本进行检测，每天分析1 个批次、2 个浓度，每个浓度重复测量3 次，连续测量5天，分别计算均值（xˉ），标准差（s）和变异系数（CV），与厂家声明CV 值进行比较，若实验结果CV 值小于厂家声明，则通过验证。

1.3.2 敏感性与特异性 收集鼻咽癌患者样本20例，健康体检人群样本20 例，均进行EB VCA 和EB EA IgA 化学发光法检测。

1.3.3 方法学比对 参考WS/T492-2016 卫生行业标准及CNANS-GL037:2019 性能验证指南，使用患者样本不少于20 份，被测物浓度、活性等在测量区间内均匀分布，并关注医学鉴定水平。

1.3.4 线性范围 参考CLSI EP6-A2 文件要求[3]，分别取EB VCA 和EB EA IgA 的高值（H）和低值（L）校准品各1 份，按5H、3H+1L、2H+2L、1H+3L 和5L 稀释，形成系列浓度血清进行测定，每个样本重复检测2 次，以稀释后的理论值为X，实测均值为Y，将所有结果标在坐标图上，计算回归方程，要求满足b值在0.95～1.05 范围之间，相关系数R2≥0.95。

1.4 统计方法

采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据，计数资料采用例数（n）和率（%）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度验证结果

EB VCA IgA 分析总精密度验证结果为低、高值样品（CV%）分别为3.978%和2.337%；EB EA IgA 分析总精密度验证结果为低、高值样品（CV%）分别为6.078%和4.131%。新产业生物的EBV VCA IgA 和EBV EA IgA 高低两个水平的精密度，均符合厂家声称的要求（＜10%）。

2.2 敏感性与特异性

检测样本中EBV VCA IgA 和EBV EA IgA 血清学检测结果针对鼻咽癌样本检测阳性率（敏感性）分别为100%和86.36%，累计阳性率（敏感性）达100%，特异性是95.24%；VCA IgA 临床准确性为97.56%；EA IgA 准确性为90.70%。两者联合检测可以达到100%。

2.3 方法学效果比对结果

20 例鼻咽癌患者样本中，EB VCA IgA 化学发光法与间接免疫荧光法血清滴度的阳性符合率可达95.24%，EB EA IgA 化学发光法与间接免疫荧光法血清滴度的阳性符合率可达95%，符合总体判断标准（＞80%）。见表1、表2。

表1 EB VCA IgA 方法学效果比对结果

表2 EB EA IgA 方法学效果比对结果

2.4 线性范围验证结果

选取EB VCA IgA和EB EA IgA高浓度（25.4 AU/mL,24.25 AU/mL）和低浓度（2.37 AU/mL，0.44 AU/mL）血清，稀释后的理论值和实测均值见表3，散点图见图1、图2。

图1 EB VCA IgA 线性范围散点图

图2 EB EA IgA 线性范围散点图

表3 3EB VCA IgA 线性范围验证结果（AU/mL）

3 讨论

鼻咽癌起源于鼻咽黏膜，是上皮肿瘤中较为少见的与Epstein-Barr（EB）病毒感染相关的恶性肿瘤，鼻咽癌目前属于常见的、治愈率高的肿瘤性疾病，关键在于早诊断、早治疗。然而由于鼻咽部解剖位置隐蔽，鼻咽癌早期症状不典型，给早期诊断带来了一定的困难。对于可疑鼻咽癌患者进行必要的辅助检查是对鼻咽癌进行早期诊断和鉴别诊断不可缺少的重要手段。传统的体检方法ELISA 法检测时间长，假阳性与假阴性率较高。磁微粒化学发光法检测胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1, IGF-1）的原理是采用双抗体夹心法。用抗人IGF-1 抗体包被于酶标板上，实验时标本或标准品中的IGF-1会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IGF-1 抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人IGF-1 抗体与结合在包被抗体上的人IGF-1 结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入发光底物混合液，发光底物在辣根过氧化物酶的催化下发出荧光，用化学发光免疫分析仪测定化学发光值（RLU），IGF-1 浓度与化学发光值之间呈正相关，通过绘制标准曲线求出标本中IGF-1 的浓度。因此，近年发展起来的化学发光法采用双抗夹心检测EB病毒早期抗原EB EA IgA 和衣壳抗原EB VCA IgA，检测速度快，准确性高，方便大批量人群筛查。

本研究中检测样本中EBV VCA IgA 和EBV EA IgA 血清学检测结果针对鼻咽癌样本检测阳性率（敏感性）分别为100%和86.36%，累计阳性率（敏感性）达100%，特异性是95.24%；VCA IgA 临床准确性为97.56%；EA IgA 准确性为90.70%。两者联合检测可以达到100%。

综上所示，通过化学发光法检测EBV VCA IgA和EBV EA IgA 的精密度、敏感性与特异性、方法学比对、参考区间验证，性能均可以满足实验室与临床的使用要求。可作为一种EB 病毒早期诊断的快速筛查手段。