米糠蛋白复合戊聚糖糖基化反应条件的优化及性质研究

冷雪冬, 孙华军, 朱 磊, 陈明明, 宋 妍, 杨斯琪, 钱丽丽,2,3

(黑龙江八一农垦大学食品学院1,大庆 163319)

(国家杂粮工程技术研究中心2,大庆 163319)

(黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室3,大庆 163319)

米糠是稻米加工的副产物,其中的营养成分占稻谷中总营养成分的64%[1],是一种廉价的蛋白质来源,其质量分数为10%～16%。米糠蛋白是一种优质的植物蛋白[2],主要是由清蛋白(37%)、球蛋白(36%)、醇溶蛋白(5%)、谷蛋白(22%)组成。米糠蛋白具有生物效价高等特点,在营养方面具有优越性,氨基酸组成合理平衡,相比而言赖氨酸和苏氨酸含量更高,是婴儿和特殊人群营养食品的合适成分[3-7]。由于米糠蛋白的一些功能特性较差,因此采用糖基化方法改善米糠蛋白的功能特性(例如溶解性、乳化性、起泡性等),众多研究表明糖基化改性能对蛋白质的功能性质进行改善[8,9],并且反应条件简单、迅速。

蛋白质改性方法主要有物理方法、化学方法和生物酶法[10]。物理方法是通过适度的热变性、挤压膨化和超高压等方法改变蛋白质的高级结构和分子间的聚集方式,从而改善蛋白的功能性质[11];化学方法包磷酸化、糖基化、脱酰胺化和共价交联作用等方法改变蛋白质的结构来改善其功能特性[12];生物酶法主要有蛋白酶、过氧化物酶等,通过对蛋白质分子中多肽链的断裂、分子交联或对侧链基团进行修饰,从而改变蛋白质分子的组成及理化性质影响其功能特性[13]。糖基化是将糖链以共价键的形式与蛋白质分子上的氨基相连接而形成糖蛋白,此反应仅在加热条件下自发进行不需添加催化剂[14]。戊聚糖具有多种生理活性,有益于促进肠道内双歧杆菌及乳杆菌的繁殖[15-17]、降血糖[18-20]等。糖基化反应使其米糠蛋白分子中插入羟基从而改善蛋白质的溶解度、起泡性和乳化性能等。

本实验选用米糠蛋白和戊聚糖进行糖基化反应,制备米糠蛋白戊聚糖复合物,通过在不同的反应条件(pH、温度、时间、米糠蛋白-戊聚糖比例)对该接枝反应进行分析,在单因素的基础上进行响应面分析,得出最优的米糠蛋白戊聚糖复合物制备工艺参数。并对米糠蛋白戊聚糖复合物和米糠蛋白的褐变程度、溶解性进行比较,以期为米糠蛋白戊聚糖复合物的制备及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米糠蛋白(纯度90%)、戊聚糖(纯度98%)。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、四硼酸钠,均为分析纯;邻苯二甲醛(o-Phthalic Aldehyde,OPA)、十二烷基硫酸钠(SDS),分析纯,β-巯基乙醇,生化试剂。

1.2 仪器与设备

BSA-120.4电子天平,SYG-1210恒温水浴锅,UV-2008紫外分光光度计,HJ-3恒温磁力搅拌器,ALPHA1-2真空冷冻干燥机。

1.3 实验方法

1.3.1 米糠蛋白戊聚糖复合物的制备

称取一定量的米糠蛋白,溶于pH=10的磷酸缓冲溶液中,使其体积分数为1%,磁力搅拌30 min以充分溶解。将不同比例米糠蛋白(1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)与戊聚糖充分混合,进行磁力搅拌,反应的时间和温度不同。将样品锥形瓶放置在60 ℃的水浴锅中保温反应90 min,反应过程中每隔15 min取样测定褐变值。样品置于3 500 r/min离心20 min除去不溶性物质,进行冷冻干燥。

1.3.2 米糠蛋白戊聚糖复合物接枝度的测定

接枝度(DG)采用邻苯二醛(OPA)法[21]测定:称取80 mg OPA,在2 mL甲醇溶液中搅拌;将50 mL 0.1 mol/L四硼酸钠溶液、5 mL 200 mg/mL SDS溶液、200 μLβ-巯基乙醇充分混匀,加入OPA甲醇溶液搅拌,定容至100 mL于棕色瓶中。样品测定时,称取4.00 mL OPA溶液,加入200 μL样品溶液,置于35 ℃水浴中2 min后测定340 nm处吸光值。用去离子水做为空白对照组。接枝度(DG)按公式进行计算:

式中:A0为反应前溶液吸光度值;A1为取样样品溶液吸光度值。

1.3.3 米糠蛋白戊聚糖复合物单因素实验

1.3.3.1 溶液pH对接枝反应的影响

固定蛋白的质量分数为1%,设置pH分别为7、8、9、10、11作为实验条件,其他条件为反应时间60 min、反应温度40 ℃及米糠蛋白复合戊聚糖比例为1∶2,进行单因素实验,考察不同pH对接枝度的影响。

1.3.3.2 反应时间对接枝反应的影响

固定蛋白的质量分数为1%,设置反应时间分别为30、40、50、60、70、80 min作为实验条件,其他条件为pH=10、反应温度40 ℃及米糠蛋白复合戊聚糖比例为1∶2,进行单因素实验,考察不同反应时间对接枝度的影响。

1.3.3.3 反应温度对接枝反应的影响

固定蛋白的质量分数为1%,设置反应温度分别为20、30、40、50、60、70、80 ℃作为实验条件,其他条件为pH=10、反应时间60 min及米糠蛋白复合戊聚糖比例为1∶2,进行单因素实验,考察不同反应温度对接枝度的影响。

1.3.3.4 米糠蛋白复合戊聚糖比例对接枝反应的影响

固定蛋白的质量分数为1%,设置米糠蛋白复合戊聚糖分别为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4作为实验条件,其他条件为pH=10、反应时间60 min及反应温度40 ℃,进行单因素实验,考察不同米糠蛋白复合戊聚糖比例对接枝度的影响。

1.3.4 米糠蛋白戊聚糖复合物响应面优化实验

在单因素实验基础上,采用响应面分析法考察溶液pH(A)、反应时间(B)、反应温度(C)和米糠蛋白复合戊聚糖比例(D)4个因素与接枝度(Y)进行响应面实验设计,响应面实验因素与水平表如表1所示。

表1 因素与水平

1.3.5 米糠蛋白戊聚糖复合物褐变度的测定

测定不同比例样品溶液,在不同反应时间段褐变度的变化。取样品溶液于离心管中,在3 500r/min条件下离心15 min,取上清液,用蒸馏水做空白,用0.1 mg/100 mL的SDS溶液稀释,在420 nm处测定吸光度[22],以此表示体系的褐变程度。

1.3.6 米糠蛋白戊聚糖复合物溶解度的测定

分别配置pH值分别为 3、4、5、6、7、8、9的磷酸盐缓冲液,溶解米糠蛋白及其复合物制成1 mg/mL的溶液,混合均匀。在室温下放入离心机,3 500r/min离心力下离心20 min。取上清液在280 nm 处测量吸光度,每个样品重复3次。

1.4 数据处理

数据分析和响应模型的建立由Origin 2019和Design Expert 8.6.0软件处理,采用SPSS26.0软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 米糠蛋白戊聚糖复合物单因素实验

由图1可知,随着溶液pH值的逐渐增大,米糠蛋白戊聚糖复合物的接枝度呈现上升趋势,当pH值为7～10时,接枝度显著上升,当pH等于10时接枝度最大为28.38%,pH值在10～12呈下降趋势,差异不显著。随着pH值增大使得溶液的碱性越大,浓度过高会使米糠蛋白发生变性和蛋白交联,导致蛋白质结构发生改变,从而降低样品的接枝度。接枝度在反应时间为60 min时有最高值为28.58%。此后接枝度随着反应时间的增长呈现下降趋势,最后趋于平缓。随着反应时间的增加,米糠蛋白分子结构开始发生变化,米糠蛋白中的氨基与戊聚糖中的羟基进行接枝反应;随着反应持续进行,接枝度在70 min后趋于平缓。随着反应温度的升高,接枝度呈现先升高后下降的趋势,在40 ℃取得最高值为28.49%。随着反应温度的升高,米糠蛋白结构发生轻微改变,分子中的游离氨基含量升高,浓度增加从而提高接枝反应速率,接枝度显著升高。但温度过高会引发蛋白的热变性和粒子重新聚集,游离氨基酸含量降低,从而导致接枝度下降。当米糠蛋白与戊聚糖质量比为1∶2时,其接枝度最高为28.96%,此后接枝度随着戊聚糖添加比例的改变呈现下降趋势,由于蛋白添加比例变小,戊聚添加比例增大,溶液黏稠度增加从而不利反应的发生,导致接枝度的下降。在一定的添加范围内,增加戊聚糖浓度,可提高米糠蛋白的游离氨基与戊聚糖中的羟基反应,使接枝反应向正反应方向进行。根据单因素实验可知,选取pH 10、反应时间60 min、反应温度40 ℃和米糠蛋白-戊聚糖比例1∶2作为最佳的单因素制备工艺条件。

图1 米糠蛋白戊聚糖复合物单因素影响

2.2 米糠蛋白戊聚糖复合物响应面实验

2.2.1 方差分析及回归方程

以单因素实验作为依据得出结论,响应面实验方案及结果如表2所示。

表2 响应面实验方案及结果

以pH(A)、反应时间(B)、反应温度(C)、米糠蛋白-壳聚糖质量比(D)为自变量,可得出接枝度的回归方程为:Y=28.81-0.44A-0.57B+0.13C+1.05D-2.06AB-0.72AC+1.75AD-0.69BC+0.48BD+0.26CD-2.09A2-2.67B2-0.58C2-1.39D2。

表3 响应面回归方程方差分析

2.2.2 响应面分析与优化

影响米糠蛋白戊聚糖复合物的接枝度的各个因素之间的交互作用。由各因素交互作用的响应面图,根据响应面陡峭程度和F值可以得出4个因素对米糠蛋白戊聚糖复合物接枝度的影响程度为:接枝反应温度(℃)>接枝反应时间(min)>pH>米糠蛋白复合戊聚糖质量比(g/g)。通过响应面优化可知最佳工艺参数为pH=10.11、反应时间58.71 min、反应温度44.15 ℃及米糠蛋白复合戊聚糖质量比1.00∶2.21时,在此条件下接枝度为29.07%。考虑到实际操作,将实际实验条件调整为反应温度44 ℃、反应时间60 min、pH=10米糠蛋白复合戊聚糖质量比1∶2,进行3次重复实验,取平均值得到接枝度度为29.01%,与实际相符,则模型可以较好地预测米糠蛋白戊聚糖复合物的制备。

2.3 米糠蛋白戊聚糖复合物褐变度的测定

美拉德反应会有褐色产物产生,褐变度是通过呈色物质吸光度的变化来表现美拉德反应的高级产物的形成[23],褐变程度的增加也表明反应进行程度。由图2可知,反应时间的逐渐延长,吸光度在前45 min逐渐增大,之后趋于平缓,当反应时间到70 min以后美拉德反应呈现结束或逆转。随着戊聚糖添加量增加,同一时刻不同比例样品的美拉德反应的呈现先增加后减小趋势,当添加比例为1∶2时吸光度值最高,而当比例为4∶1、3∶1或1∶4、1∶3时吸光度值有所下降,表明戊聚糖或米糠蛋白浓度提高对于美拉德高阶反应有抑制作用。

图2 米糠蛋白戊聚糖复合物褐变度的测定

2.4 米糠蛋白戊聚糖复合物溶解度的测定

由图3可知,上清液的吸光度值越高,其溶解度越高。在pH为3～9之间,溶解度先减少后增加,在pH=4附近最低,通过前后对比分析可知,米糠蛋白戊聚糖复合物的溶解度高于米糠蛋白的溶解度。溶解度与蛋白质的性质有关[24],蛋白质在酸性或碱性条件下,体系中电荷的增加,有利于蛋白分子与水分子间作用,溶解性呈现逐渐增大趋势[25]。可知糖基化改性能提高米糠蛋白溶解度对于pH变化环境下的敏感性,使得糖基化后的米糠蛋白与水的亲和力进一步提高。

图3 糖基化反应对米糠蛋白溶解度的影响

3 结论

实验以米糠蛋白和戊聚糖为原料,采用糖基化方法进行复合,探究不同反应条件对接枝度的影响。通过响应面试验建立其模型并进行工艺优化,得到米糠蛋白戊聚糖复合物优化后的最佳工艺条件为pH=10.11、反应时间58.71 min、反应温度44.15 ℃及米糠蛋白复合戊聚糖质量比1.00∶2.21时,在此条件下接枝度为29.07%。获得最优的制备条件,为后续米糠蛋白特性的研究提供了基础。