热处理激发油茶籽油中多酚与美拉德产物变化及互作研究

王龙祥,罗 凡, 杜孟浩, 方学智, 钟海雁

(中国林业科学研究院亚热带林业研究所1,杭州 311400)

(中南林业科技大学食品学院2,长沙 410004)

油茶(CamelliaoleiferaAbel),为山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)常绿小乔木或灌木,是我国特有的经济效益和生态效益俱佳的木本油料物种,是联合国重点推广食用油。2022年中央一号文件和《林草产业规划(2021—2025年)》中明确指出支持扩大油茶种植面积,茶油年产量将在“十四五”时期从72万t增长到200万t。

茶油中除含有较高不饱和脂肪酸外,还具有丰富的活性抗氧成分,如多酚、生育酚、甾醇等[1]。研究表明,油脂氧化稳定性是这些活性抗氧成分共同作用的结果,而抗氧成分间存在着相加、协同及拮抗等互作关系[2]。表1列出了一些常见的抗氧活性物质相互作用研究。

课题组在研究抗氧活性物质时发现适度的热处理会使得油茶籽油的抗氧化性增高[9],且油料热处理后抗氧活性物质均有不同变化。研究证明多种抗氧化功效因子联合作用比单一组分具有更好的抗氧化效果[10],因此热处理后抗氧活性物质变化及其之间相互作用值得深入研究。研究以油茶籽为原料,研究热处理后油茶籽毛油中多酚、美拉德产物含量动态变化、脂质抗氧化性及相互作用,以期对茶油氧化稳定机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

油茶籽中未成熟、破损和霉变粒在原料清理时被去除。参考标准方法[11,12]测定油茶籽含水率为(8.81±0.04)%,油茶籽含油率为(37.14±1.09)%。油茶籽处理方式及条件:在90、100、110、120、130、140 ℃分别处理30、60、90、120 min。处理完成后通过液压榨取油茶籽油毛油,冷藏备用。

1.2 实验试剂

SPE柱(500 mg/3 mL);丙酮醛(MGO)、3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG)、乙二醛(GO)、5-羟甲基糠醛(5-HMF)、Trolox(97%)、4-羟基苯乙酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯乙酸、阿魏酸、没食子酸、邻香豆酸、原儿茶酸、邻香草醛、芥子酸、对香豆素、绿原酸、反式肉桂酸、焦性没食子酸;氢氧化钠、邻苯二胺、氢氧化钾、过硫酸铵、无水碳酸钠、没食子酸、乙酸乙酯、无水乙酸钠、冰乙酸、浓盐酸、氯化铁、氯化钠、无水乙醇;色谱纯正己烷、甲醇、石油醚。

1.3 仪器与设备

S-114分析天平,MG38-CB-FAA烤箱,6YY-190自动液压榨油机,UV-2550紫外可见光分光光度计,THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器,Avanti J-E冷冻离心机,743 Rancimat油脂氧化稳定性测定仪。

1.4 实验方法

油茶籽毛油非极性脂质制备:参考文献方法[13],取油茶籽毛油100 g溶于1 000 mL正己烷中,通过填充70 g中性氧化铝(180 ℃活化4 h,水分活度阶段Ⅱ)的洗脱柱,之后收集物经氮吹吹干并于-20 ℃保存,且使用期限不超过10 d。

多酚物质及含量测定:参考文献[14],使用HPLC进行分析测定,测定结果以μg/g表示。

美拉德产物(5-HMF、MGO、3-DG、GO)测定:参考文献[5,6]采用HPLC测定5-HMF、MGO、3-DG、GO含量,测定结果以μg/g表示。

氧化诱导时间测定:参考文献[17]和GB/T 21121—2007,取4.0 g油茶籽毛油非极性脂质,置于反应管底部,加入1 mL样液,混匀后氮吹吹干溶剂。测量池中加入50 mL 去离子水,测量温度110 ℃,空气流量为10 L/h,以诱导时间突变点为反应终点,进行测定。

协同作用统计学分析:参考文献[18],协同百分比根据各油样的诱导时间(IP)按公式计算:

(1)

Synergism=

(2)

式中:F为所测定的不同酚类物质及其混合物的有效性,表示为稳定因子;IPinh表示添加抑制剂下化合物的诱导期值/h;IP0表示空白样品的诱导期值/h;Synergism为协同百分比,正值表示为协同作用,负值表示为拮抗作用,IPinH1、IPinH2、IPinH3表示添加不同抑制剂后其诱导期值/h。

1.5 数据处理

所有数据平行测定3次,采用Microsoft Excel 2007、SPSS 22、Origin 2021进行统计分析。

2 结果分析

2.1 油茶籽油多酚与美拉德产物含量动态分析

2.1.1 多酚含量动态分析

油茶籽毛油中多酚含有游离酚酸、黄烷醇、黄酮醇等多种物质。结合参考文献[19,20]研究内容,将总酚样液与酚类标样经HPLC进行分析比对,具体结果见表2。总酚样液中含有没食子酸(GA)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和反式肉桂酸(tCA),且当油样加热到120 ℃时,其所提取的总酚样液中检测到焦性没食子酸(PG)。随着温度升高,GA、DOPAC和tCA含量先降低后升高,处理至140 ℃时,GA、DOPAC与tCA含量较空白对照分别升高了2.07倍、3.18倍和3.33倍。刘国艳等[21]研究酚类不同形态化合物时发现不同形态酚类化合物主要物质组成仅在含量上存在差异,推测含量先降低后升高是因为温度较低时多酚物质抑制油脂氧化消耗使得含量降低,比如温度高促使顺式肉桂酸变成不可逆的反式肉桂酸,随着温度升高酚类物质受热溶出和部分结合态酚类受热分解产生游离酚类导致含量升高。PG可能是原先以结合态存在或者是其他物质降解转化而成,如GA受热脱羧后形成PG[22]。

表2 油茶籽毛油中酚类物质含量动态变化

2.1.2 美拉德产物含量动态分析

5-HMF是由Amadori产物降解,后经脱水和缩醛反应形成的一种美拉德产物[23],其可以通过和胺反应生成类黑素类物质,是反映褐变程度重要的指标之一。除5-HMF外,丙酮醛(MGO)、乙二醛(GO)、3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG)也是具有较强抗氧化性的美拉德产物,其属于α-二羰基化合物,是食品中风味和色泽物质的重要前体,具有活性高稳定性低特点[24]。经测定,油茶籽毛油中GO在90～140 ℃、加热120 min以内含量低于检测限。5-HMF、3-DG、MGO含量变化如表3所示。

表3 油茶籽毛油中5-HMF、3-DG、MGO含量动态变化

热处理后温度的变化都会影响美拉德反应速率[25],进而影响美拉德产物含量。5-HMF、3-DG、MGO随着温度的升高其含量先降低后升高。推测初始温度较低,美拉德反应不活跃,三者氧化消耗大于生成:如90 ℃时,三者质量分数最低,分别为初始对照样品的76.21%、23.62%、44.37%。而当温度逐渐增加时,美拉德反应逐渐活跃,5-HMF、3-DG、MGO通过降解、烯醇化、脱水等一系列反应使得生成大于氧化消耗,含量增加[26]:如140 ℃时,三者含量最高,分别为初始对照样品的1.69、7.19、4.27倍。

2.2 协同作用分析

2.2.1 多酚与美拉德产物抗氧化性分析

有研究指出相同抗氧物质在不同环境下其抗氧化能力也存在一定差异[27]。而非极性脂质在不添加引发剂的情况下,主要的抑制反应发生在抗氧化剂和脂质过氧自由基之间[28]。因此选定向非极性脂质中添加多酚与美拉德产物,通过测定其氧化诱导时间来分析其抗氧能力存在的差异。经气相色谱测定[29],制备所得到的非极性脂质底物的脂肪酸组成为棕榈酸(8.48±0.01)%、硬脂酸(1.56±0.03)%、油酸(80.02±0.04)%、亚油酸(9.37±0.03)%、亚麻酸(0.22±0.05)%、花生一烯酸(0.35±0.03)%。图1与表4为添加酚类与美拉德产物后非极性脂质氧化诱导时间变化。

图1 多酚对非极性脂质氧化诱导时间影响

表4 美拉德产物对非极性脂质氧化诱导时间影响

由图1得,添加PG、GA、DOPAC的非极性脂质的氧化诱导时间随着其质量分数增加具有显著性变化(P<0.05),三者质量分数为25.0 μg/g时的氧化诱导时间分别是添加2.5 μg/g的2.89、1.79、4.15倍。而添加了tCA的非极性脂质其氧化诱导时间随着tCA浓度变化不显著(P>0.05),推测酚羟基在抑制脂质过氧化中具有重要影响[30],而tCA没有酚羟基,因而在其添加的非极性脂质的氧化诱导时间变化不显著。其余3种酚类物质因具有酚羟基显示出较为显著的脂质自由基清除作用。

由表4得添加美拉德产物后使得非极性脂质氧化稳定时间增加。添加5-HMF、3-DG的非极性脂质的氧化诱导时间随着浓度增加具有显著性变化(P<0.05),最大值分别为质量分数5.0、7.5 μg/g处,是初始空白样品的1.13和1.21倍。而添加了MGO的非极性脂质的氧化诱导时间随着浓度增大先增加后趋于平缓变化不显著(P>0.05)。推测5-HMF、3-DG含有的羟基使得在脂质过氧化中起到了显著的抑制作用,因此其脂质过氧化抑制作用随着浓度具有显著性变化。而MGO可能通过抑制油脂中某些特定物质来达到脂质抗氧化作用,如MGO氧化成丙酮酸后,其作为α-酮酸可与通过脱碳基反应来抑制脂质过氧化。

2.2.2 多酚间复配协同效应分析

为了进一步研究多酚物质间抗氧互作关系,将多酚物质进行复配,测定其协同效应。表5为复配后非极性脂质氧化诱导时间和稳定系数变化。结合氧化诱导时间和稳定性得,单独添加中,PG的氧化诱导时间最高,tCA的氧化诱导时间最低,PG为tCA的2.5倍。在两两复配中,氧化诱导时间最高的是PG+GA,最低是GA+tCA,二者相差2.09倍。在三三复配中,最高的是PG+GA+DOPAC,最低的是GA+DOPAC+tCA,而二者相差2.47倍。四者混合后比PG高22.53%,比PG+GA高32.57%,比PG+GA+DOPAC低3.80%。为进一步了解多酚内互作关系,将4种酚类物质复配后测定所得氧化诱导时间按照1.4中协同作用公式计算协同百分比,结果如图2所示。

图2 复配后协同百分比变化

表5 复配后非极性脂质氧化诱导时间和稳定系数变化

在两两复配中,协同百分比最低的是GA+tCA,为-(54.08±1.44)%,最高为tCA+DOPAC,为(5.71±4.04)%。三三复配中最高GA+DOPAC+PG,为(14.21±6.96)%,最低为GA+tCA+DOPAC,为-(29.01±6.11)%。四者全混合为(7.05±1.92)%。由此可得,在两两复配中tCA+DOPAC为协同关系,其余均为拮抗关系;三三复配中,GA+DOPAC+PG为协同关系,其余为拮抗关系;全混合后呈协同关系。推测在复配中由于tCA中苯环上缺少酚羟基,导致其抑制脂质过氧化反应较弱,且tCA、GA和DOPAC中含有的羧基可能会随着脂质过氧化进程中和多酚中的酚羟基反应形成酯类物质[31],引起抗氧化能力发生变化,进而影响协同百分比。

2.2.3 多酚与美拉德产物复配协同效应分析

为了进一步研究多酚物质与美拉德产物间抗氧互作关系,将多酚与美拉德产物进行复配,测定其协同效应。表6为复配后非极性脂质氧化诱导时间和稳定系数变化。结合氧化诱导时间和稳定性得,在美拉德产物单独添加中,MGO的氧化诱导时间最高,5-HMF的氧化诱导时间最低,MGO为5-HMF的1.07倍。在两两复配中,最高的是5-HMF+3-DG,最低的是5-HMF+MGO,二者相差2.48%。三者混合后比MGO高0.96%,比5-HMF+3-DG高1.93%。将复配后所得数据进行协同百分比计算,所得结果如图3所示。

图3 复配后协同百分比变化

表6 复配后非极性脂质氧化诱导时间和稳定系数变化

美拉德产物在两两复配中均为拮抗关系,协同百分比最低的是MGO+3-DG,为-(47.14±6.06)%;三者全混为拮抗关系。多酚与美拉德产物全混合为协同作用,为(65.35±4.24)%,比多酚全混合高。推测美拉德产物自身和多酚间的复配会产生相互作用使得抗氧能力发生变化,如MGO与3-DG、丙酮等物质相互作用导致褐变程度增加[32],羟基和醛基进行缩合来增加羰基活性,多酚与MGO反应生成甲基乙二酮-苯酚加和物等。

3 结论

以油茶籽油毛油为对象,研究热处理激发后油茶籽油中多酚与美拉德产物含量、抗氧能力及相互作用。结果表明,油茶籽油多酚中含有没食子酸(GA)、焦性没食子酸(PG)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和反式肉桂酸(tCA)4种酚类物质且随温度升高含量具有显著性变化;GA、PG、DOPAC抗氧能力随浓度增加而增加,tCA抗氧能力随浓度变化不显著。对4种酚类物质互作关系进行了分析,发现两两复配中tCA+DOPAC为协同关系,其余为拮抗作用;三三复配中GA+DOPAC+PG为协同作用,其余为拮抗作用;全混时为协同作用。美拉德产物5-HMF、3-DG、MGO含量随着温度的升高其含量先降低后升高。5-HMF、3-DG抗氧能力随着浓度的升高先增加后降低,MGO抗氧能力随着浓度的变化先增加后趋于平缓。5-HMF、3-DG、MGO两两复配和全混时均为拮抗作用。多酚与美拉德产物全混时为协同作用,说明加热后油茶籽毛油中多酚和美拉德产物的同时存在将增加油脂的抗氧化性。

油茶籽油氧化稳定性是多种抗氧物质共同作用的结果,除多酚、美拉德产物外,还有甾醇、角鲨烯、维生素E等多种活性抗氧成分。多酚、美拉德产物与其他不同组分之间相互作用,对整个油茶籽油的抗氧化性机制影响等,有待进一步研究。