免疫快速同步检测玉米中5种真菌毒素胶体金试纸条的构建和应用

邢常瑞, 郑 欣, 董 雪, 李光磊, 刘崇靖,张 勋,2, 袁 建, 鞠兴荣

(南京财经大学食品科学与工程学院;江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心;江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室1,南京 210023)

(山东美正生物科技有限公司2,日照 102100)

玉米是生物经济的基本原料,用途十分广泛,自2012年以来超过稻谷成为我国第一大粮食作物,其产业链和价值链不断增长和扩张。然而,玉米在田间收获、干燥、运输和储藏等多个环节中都易受到真菌的污染而导致黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮毒素等多种真菌毒素危害[1],影响以玉米为原料的相关食品的质量,对居民身体健康造成潜在的健康风险。

研究表明谷物中真菌毒素的混合污染对生物体造成的危害情况更为复杂,风险更大[2],当多种真菌毒素同时存在时,他们之间可能发生拮抗或协同作用,将对动物机体产生不同程度的负面影响。目前在细胞水平有证据表明毒素共存会导致不同的联合毒性。比如James等[3]研究表明DON和ZEN共存时在细胞毒性和DNA断裂方面呈现加和作用,在DNA合成方面呈现亚加性作用,在脂质过氧化反应方面呈现协同作用。2018—2020年间来自欧洲、非洲、亚洲和南美洲的超过1 000份玉米样品的检测结果表明,75%的样品受到了多重毒素的污染[4]。一项针对广西省百色市玉米真菌毒素污染状况的调查表明,收集自2017—2019年间的玉米样品中AFB1、DON和ZEN的检出率分别为91.94%、5.38%和45.16%;其中,AFB1和ZEN超标率为68.28%和22.04%[5]。玉米中真菌毒素的多重污染在粮食收储运过程中备受关注,在极端天气条件下情况更为严重。

目前,粮食中真菌毒素的检测方法有液相色谱法(LC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、免疫学检测方法和电化学检测方法等。LC和LC-MS/MS方法可以对多种目标物进行定量检测,灵敏度较高,适用于多种真菌毒素的同时检测[6]。然而,仪器检测方法价格昂贵,场所受限,且需要熟练的操作人员,不适合用于粮食收获及收购现场多毒素的快速筛查。近年来,单一真菌毒素的免疫层析试纸条(ICA)由于其特异性好、准确度高、使用简便、价格便宜、易于推广等特点得到了广泛应用[7, 8],因此,将ICA应用于多种真菌毒素的检测开始受到人们的关注并具有极大的推广价值[9-11]。目前,由于合成方法简单、可视化判断方便、标记方法成熟,胶体金是免疫试纸条中使用较多的信号材料。黄馨雨[12]利用胶体金作为免疫标记物制备可同时检测FB1和DON的免疫层析试纸条。Kong等[13]利用抗体的交叉性能,可以通过多线检测试纸条方法实现20种真菌毒素的半定量和定量检测,Liu等[14]建立了基于手机双模检测方法,实现谷物中多种真菌毒素胶体金和荧光双模检测。因此,建立快速、高通量、高灵敏度的多种真菌毒素同时检测方法,用于粮食加工与收储相关企业现场筛查具有十分重要的意义。

本研究优化了玉米中的多种毒素同时提取前处理方法,建立一种同步快速检测玉米基质中5种真菌毒素胶体金多检测线试纸条,该方法具有操作简便、灵敏度高,检测快速和成本较低等优点,可以在粮食仓储和加工企业中进行推广和应用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

黄曲霉毒素B1(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)、伏马毒素B1(FB1)和T-2毒素(T-2)标准品溶液,单克隆抗体(anti-AFB1antibody、anti-FB1antibody、anti-T-2 antibody、anti-DON antibody和anti-ZEN antibody),包被抗原(AFB1-BSA、FB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA)和羊抗鼠IgG (H+L)。

1.2 仪器设备

HM 3030三维划膜喷金,ZQ 2002微电脑自动斩切机,真空冷冻干燥机,高速离心机,Xevo TQ液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪。

1.3 胶体金免疫层析试纸条方法的建立

1.3.1 单克隆抗体标记金纳米粒子的制备

取50 mL离心管加入10 mL金溶液,再加入一定量的0.1 mol/L K2CO3溶液调节合适的pH,盖紧盖子后用手轻轻摇晃至均匀。分别将5种真菌毒素的单克隆抗体,用0.002 mol/L的pH 8.0硼酸盐缓冲液(BB)稀释到0.2 mg/mL,分别加入一定量的抗体溶液,将各个混合物在25 ℃下恒温振荡(500 r/min)1 h后,加入2 mL 10% BSA封闭,室温振荡2 h(500 r/min)。以10 000 r/min离心30 min,去除上清液,将沉淀物溶解在2 mL金标悬浮液中。根据流程分别制备AuNPs-AFB1mAb、AuNPs- FB1mAb、AuNPs- T-2 mAb、AuNPs- DON mAb和AuNPs- ZEN mAb的金标抗体,并分别以每孔50 μL将其转移到96孔酶标板中,真空冷冻干燥后密封以防受潮[15]。

1.3.2 多检测线免疫胶体金试纸条的制备

将NC膜、样品垫和吸收垫逐层粘贴在PVC板上,制备免疫层析试纸条。硝酸纤维素膜贴在 PVC底板中部,吸水垫和样品垫分别贴在PVC底板的上下两端,并且与硝酸纤维素膜有1.5 mm左右的重叠。使用划膜喷金仪,以1.0 μL /cm的速率分别将抗原AFB1-BSA、FB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA和羊抗鼠二抗喷到硝酸纤维素膜表面形成测试线(T-1线、T-2线、T-3线、T-4线和T-5线)和控制线(C线),每条线之间的距离为3 mm,将组装好的卡片置于37 ℃电热鼓风干燥箱中干燥6 h。组装好的卡片烘干后用微电脑自动斩切机切成3.8 mm宽的条状,装于塑封袋中,放入干燥柜中保存。

1.3.3 玉米样品中真菌毒素前处理条件优化

首先确定玉米样品中5种真菌毒素同时提取条件参数,并对提取溶剂的组分进行了优化。准确称取1 g(精确到0.01 g)空白玉米样品于10 mL离心管,加入4 mL提取溶剂(V乙腈∶V水∶V甲酸=70∶29∶1),涡旋提取20 min,然后以6 000 r/min离心10 min,吸取0.5 mL上清液于1.5 mL离心管中,加入0.5 mL水并涡旋混匀,在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min,上清液过0.2 μm的有机相滤膜,收集滤液于进样瓶中。将5种毒素的标准溶液添加到空白的玉米样品提取液中,制备一系列浓度梯度的标准溶液,同时将空白玉米样品提取液作为对照。

本实验选择体积分数分别为60%、70%、80%、90%的乙腈水溶液和含体积分数为0.1%甲酸的60%、70%、80%、90%的乙腈水溶液作为提取溶剂。称取8组1 g玉米阴性质控样品,每组包含3个平行,分别添加一定浓度的5种真菌毒素的混合溶液,按照以上处理步骤进行处理后通过液质联用仪器进行检测,计算不同提取溶剂的提取率,确定最佳提取溶剂。

1.3.4 胶体金试纸条测定玉米中的真菌毒素

首先,在阴性玉米粉样品中加入一系列浓度的真菌毒素溶液制备基质添加样品。玉米粉中添加AFB1终质量分数为0.0、8.0、16.0、40.0、80.0、160.0、400.0、800.0 μg/kg,FB1终质量分数为0.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0、1 000.0、2 000.0 μg/kg,T-2终质量分数为0.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/kg,DON终质量分数为0.0、40.0、80.0、200.0、400.0、800.0、2 000.0、4 000.0 μg/kg,ZEN终质量分数为0.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/kg。

选择优化后的提取溶剂对玉米样品中的五种真菌毒素进行提取,并通过多重免疫胶体金试纸条进行检测。分别称取玉米粉1.0 g,按不同浓度进行加标后,加入4 mL乙腈-水(体积比为90∶10)溶液,快速振荡1 min后,涡旋混匀20 min。6 000 r/min离心5 min后,将上清液转移到10 mL离心管中备用。分别取1 mL上清液加入10 mL离心管中,在氮气流下吹干,以消除有机试剂对试纸条显色的影响,最后加入5 mL PBST溶解样品。溶液中AFB1的质量浓度为 0.0、0.4、0.8、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 ng/mL,FB1的质量浓度为0.0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL,T-2的质量浓度为0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL,DON质量浓度为0.0、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0 ng/mL,ZEN的质量浓度为0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL。

分别取150 μL样品溶液加入含有5种真菌毒素金标抗体的微孔中,室温反应15 min。试纸条检测结果通过手机拍摄记录检测结果并通过肉眼判断消线值(Cut off Value,免疫层析试纸条T线显色完全消失时对应真菌毒素的浓度值)。通过ImageJ软件对5条检测线的灰度条带进行自动提取,并计算峰面积,以加标浓度和检测线的峰面积建立5种真菌毒素的标准曲线,计算最低检测限。

1.4 应用多重胶体金试纸条快速同步检测玉米样品中的真菌毒素

利用所制备的胶体金试纸条对含有真菌毒素污染的玉米实际样品进行检测,检测结果通过肉眼判断,并结合Image J对样品进行定量判定。

2 结果与讨论

2.1 玉米基质中5种真菌毒素前处理方法优化

2.1.1 玉米基质中5种真菌毒素标准曲线建立

将5种毒素(AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN)混合的标准溶液添加到空白玉米样品提取液中,并稀释成一系列浓度梯度,同时将空白玉米样品提取液作为阴性对照,液质测定结果见表1,结果表明5种真菌毒素标准曲线的线性相关系数均大于0.998,线性关系良好。

表1 玉米基质中5种真菌毒素的线性关系及检测限

2.1.2 玉米基质中5种真菌毒素前处理优化

选择(添加体积分数为0.1%甲酸)8种不同的乙腈水溶液提取溶剂,涡旋20 min,比较不同提取溶剂下的5种真菌毒素的添加回收率,结果见图1。

图1 玉米基质中样品提取溶剂的优化

从图1中可以看出,提取溶剂不同,同种真菌毒素的提取效率存在差异;相同提取溶剂对于每种真菌毒素提取效率也不同。对于AFB1,添加体积分数为0.1%甲酸的70%、80%乙腈水溶液的回收率高于未添加甲酸的同等乙腈浓度的提取溶剂,而添加体积分数为0.1%甲酸的60%乙腈水溶液的ZEN回收率高于未添加甲酸的60%乙腈水溶液。AFB1,FB1和T-2毒素在提取液为90%乙腈水溶液时,回收率最高;DON在提取溶剂为80%乙腈水溶液时回收率最高,其次为体积分数为90%乙腈水溶液;ZEN在提取溶剂为体积分数为90%乙腈水溶液和添加体积分数为0.1%甲酸的乙腈水溶液时,回收率相当。考虑这5种真菌毒素的提取效率,选择体积分数为90%乙腈-水溶液作为玉米基质中5种真菌毒素的最佳提取溶剂。

2.1.3 玉米样品添加回收实验

分别向玉米阴性样品中添加低、中、高3个浓度水平的5种真菌毒素的混合标准溶液,AFB1/FB1/T-2/DON/ZEN加标质量分数分别为1/5/5/50/5、2/20/20/200/20、4/40/40/400/40 μg/kg。按照优化的提取条件处理样品,每个加标水平重复3次(n=3),并计算玉米基质中5种真菌毒素的加标回收率及相对标准偏差。玉米基质中低、中、高3个浓度添加水平的加标回收率AFB1为99.3%～113.3%,FB1为100.5%～103.4%,T-2为71.9%～81.1%,DON为73.4%～87.6%,ZEN为106.9%～111.9%,相对标准偏差在0.9%～7.5%之间,表明该方法回收率高、准确度较好。

因此,本实验所优化的提取方法适用于玉米样品中5种真菌毒素的同时提取,并用于后续胶体金试纸条玉米样品的前处理。

2.2 玉米基质中5种真菌毒素多重检测胶体金试纸条方法的建立

当150 μL含有高浓度目标毒素的溶液添加到微孔,目标物(AFB1、FB1、T-2、DON、ZEN或全部毒素)与对应毒素金标抗体特异性结合,形成金标抗体-毒素复合物。然后,将组装好的免疫层析试纸条插入微孔中,5种毒素的金标抗体-目标毒素复合物从样品垫端向吸水垫端移动。在向上迁移的过程中,被结合的金标抗体不会与固定在硝酸纤维素膜T线上的包被原(AFB1-BSA、FB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA和ZEN-BSA)发生特异性结合,T线不显色;而金标抗体-目标毒素复合物将与羊抗鼠二抗IgG发生反应,C线显色。当没有目标物或者浓度非常低时,大部分的金标抗体处于游离状态,在自下而上流经硝酸纤维素膜,与T线上的各毒素包被原发生特异性抗原抗体反应,形成金标抗体-毒素包被原复合物,而多余的金标抗体将被控制线上的羊抗鼠二抗IgG结合,从而在T线和C线位置上显示出明显的红色条带。待测样品中目标毒素的含量与T线条带的显色值呈反比例关系。

玉米基质中5种真菌毒素多重检测胶体金试纸条实验结果见图2。当检测溶液中AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN的质量分数分别为4.0、50.0、5.0、20.0、10.0 ng/mL时,T线颜色基本完全消失。根据样品提取稀释倍数换算,相当于玉米样品中同时含有AFB1、FB1、T-2、DON、ZEN的质量分数分别为80.0、1 000.0、100.0、400.0、200.0 μg/kg时,免疫胶体金试纸条上的5条检测线颜色基本完全消失。

图2 胶体金免疫层析试纸条同步检测玉米基质中5种不同浓度的真菌毒素

使用Image J提取多重检测试纸条检测线的灰度面积,根据检测样品溶液浓度和对应的面积建立玉米基质中五种真菌毒素的标准曲线,结果见图3。当玉米样品中AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN的值分别为8.0、20.0、10.0、40.0、20.0 μg/kg时,各真菌毒素对应的T线显色值明显比阴性对照显色值浅,表明应用软件分析检测线灰度值的变化,可以获得更低的检测限。

图3 玉米基质中5种真菌毒素的标准曲线

2.3 应用多重胶体金试纸条检测玉米样品中5种真菌毒素

对11个玉米样品用多重胶体金试纸条方法进行检测,用手机记录检测结果,并进行肉眼观察判定,结果见图4。

图4 多重胶体金试纸条检测实际玉米样品中的5种真菌毒素

由检测结果可知,部分样品中DON和ZEN浓度超过消线值,表明实际样品中这2种毒素存在高浓度的污染;同时,用Image J软件提取天然污染玉米样品的灰度值,结合玉米基质多毒素的标准曲线进行计算,可以得出污染玉米样品中真菌毒素的浓度值。分析实际样品的检测结果表明,1号玉米样品中,DON、ZEN的灰度值为0,肉眼可观察到检测线消失,因此可以判定DON质量分数大于400 μg/kg,ZEN质量分数大于200 μg/kg。同理,样品3、4、5、6中DON质量分数均大于400μg/kg,ZEN质量分数均大于200 μg/kg。样品2中AFB1的灰度值192.61,结合标准曲线可知,AFB1的质量分数约为100 μg/kg。样品7中DON和ZEN的灰度值分别为72.95和156.78,结合标准曲线知,DON的质量分数大于400 μg/kg,ZEN的质量分数约为95 μg/kg。样品8中DON的质量分数大于400 μg/kg,ZEN的质量分数约为70 μg/kg,样品9中,ZEN的质量分数约为160 μg/kg,样品10中,ZEN的质量分数约为120 μg/kg,样品11中,DON的质量分数大于400 μg/kg。11个样品中,除样品2以外,其他样品中的ZEN和DON含量较高。样品2虽受到ZEN和DON毒素的污染较小,但AFB1毒素污染的程度较重,不适合用于直接消费或作为食品原料使用。

3 结论

本研究优化了适用于玉米样品中多种真菌毒素同时提取的样品提取溶剂并进行添加回收实验,建立5种真菌毒素同时检测标准曲线。利用优化后的最佳提取溶剂对11个玉米实际样品进行前处理,结合胶体金试纸条对其进行检测,发现样品中存在不同程度的AFB1、DON和ZEN污染。本研究所研制的多重胶体金试纸条能用于玉米的现场快速检测,并结合Image J软件能够进行定量分析。