LC-MS/MS测定大豆中苯并烯氟菌唑残留量

王永芳, 陈其勇, 俞子萱, 李淑静

(天津海关动植物与食品检测中心,天津 300461)

苯并烯氟菌唑(benzovindiflupyr),是吡唑酰胺类杀菌剂,具有新型作用机制的琥珀酸脱氢酶抑制剂[1],通过抑制病原菌的琥珀酸脱氢酶活性,导致病原菌的死亡,从而达到防治病害的效果[2,3]。苯并烯氟菌唑广谱、高效、持效期长,可广泛应用于叶面病害和土壤病原菌的防治,对大豆、小麦、玉米、花生常见作物的小斑病及灰霉病具有良好的防效[4],巴西、美国等多个大豆出口国进行了苯并烯氟菌唑的药剂登记使用[5-8]。

苯并烯氟菌唑与现有杀菌剂无交互抗性,是一个极具潜力的杀菌剂,也是重要的抗性管理工具[9,10]。苯并烯氟菌唑分子式为C18H15Cl2F2N3O,熔点为148.4 ℃,水中溶解度为0.98 mg/L(25 ℃),为弱极性化合物。该杀菌剂对植物无风险,对虹鳟鱼和海洋无脊椎动物高毒,在土壤中相当稳定,不易水解、光解[11]。GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[12]中只明确了苯并烯氟菌唑在大豆中的最大残留限量0.08 mg/kg,并未制定检测标准,目前我国没有检测苯并烯氟菌唑的相关国家标准和行业标准。巴西对豆类中苯并烯氟菌唑的限量要求为0.05 mg/kg,美国对大豆中苯并烯氟菌唑的限量要求为0.07 mg/kg,欧盟对大豆中苯并烯氟菌唑的限量要求为0.2 mg/kg。目前检测苯并烯氟菌唑的文章资料有隋程程等[13]发表的动物源性食品中苯并烯氟菌唑的检测,姜宜飞等[14]发表了苯并烯氟菌唑原药高效液相色谱分析方法研究,鲜有发表大豆中苯并烯氟菌唑的液相色谱串联质谱的检测方法。

我国是目前世界最大的大豆进口国,根据海关数据,2021年进口大豆占全国总需求的85.5%[15]。大豆主要用来压榨制作大豆油,豆粕用作饲料,大豆中的苯并烯氟菌唑残留容易转移到大豆油中,残留到豆粕中。经查阅文献,苯并烯氟菌唑为中毒类农药, 为了保障进口食品的质量安全,保障大众餐桌上的安全,本研究建立了一种由QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)进行样品提取、净化,LC-MS/MS进行检测的快速高效的方法,为相关执法部门提供技术支撑,同时为制定相关标准提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料、试剂和仪器

大豆:来源于超市和菜市场。

苯并烯氟菌唑:纯度>98.0%;乙腈;甲醇;乙酸铵(>98.0%),氯化钠(>99.5%);无水硫酸镁;甲酸:色谱纯,乙酸:色谱纯;乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶(PSA):40～60 μm;十八烷基硅烷键合硅胶(C18):40～60 μm;陶瓷均质子。

1290- 6460液相色谱串联质谱仪,AL204-IC型电子天平,Promax-2020型水平往复振荡器,XH-D型涡旋混合器,旋转蒸发仪,离心机,纯水仪,1000-Y型高速多功能粉碎机。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取10.0 mg标准物质,用乙腈溶解,配制成1 mg/mL的标准溶液,于-20 ℃冰箱进行保存。根据检测需要,用乙腈逐级稀释至所需浓度。

标准工作曲线的配制:选择空白大豆基质,将上述储备液逐级稀释,配制成质量浓度为0.002、0.004、0.010、0.02、0.04、0.10、0.20 mg/L系列标准工作溶液。

流动相配制: 0.1%甲酸-水溶液: 1 L高纯水中, 加入1 mL 甲酸,摇匀,常温保存,现用现配。10 mmol乙酸铵-0.1%甲酸-水溶液:称取乙酸铵0.78 g,溶解于1 L高纯水中,再加入1 mL 甲酸,摇匀,常温保存,现用现配。

1.2.2 色谱条件

色谱柱:Eclipse C18,100 mm×2.1 mm,1.7 μm; 流速:0.3 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μL;流动相:流动相A:乙腈;流动相B:0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱程序:0～1 min,10%A;1～7 min,100%A;7～8 min,10%A。

1.2.3 质谱条件

离子化模式:电喷雾离子源,负离子模式扫描; 检测方式:多反应监测模式;电喷雾电压:3 500 V;雾化气压力:45 psi;离子源温度:350 ℃;其他参数见表1。

表1 苯并烯氟菌唑质谱参数

1.2.4 样品前处理

提取:取2 g大豆均质试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入5 mL水涡旋混匀,静置15 min, 加入含1%乙酸乙腈10 mL,加入2 g氯化钠,剧烈震荡1 min,8 000 r/min离心5 min,上清液待净化。

净化:吸取4 mL上清液于15 mL 离心管中,加入200 mg C18粉末,200 mg PSA粉末,涡旋混匀1 min。8 000 r/min离心5 min,吸取上清液过微孔滤膜,用于测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的确定

随着大众对食品质量安全要求的不断提升,对实验室检测水平及能力也提出了更高的要求,不但检得准,检得全,还要检得快。目前市场上的商品琳琅满目,这就造成检测种类多,检测基质复杂等问题,常规的农药残留检测分析过程包括:匀浆、萃取、浓缩、净化和分析,在整个过程中样品前处理是最繁琐,最花费时间的步骤,同时也是影响分析结果的精确度和准确度的重要步骤。其中容易造成目标物损失的是浓缩和净化步骤,为提升整个实验的检测效率,Schenck等[16]开发了QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)方法, 自2003年以来,各国研究者都有所研究,建立了很多改进的方法[17-20]。目前经过改良的QuEChERS前处理方法很受青睐。

本方法采用改良的QuEChERS方法进行前处理,结合大豆基质特点,含有大量油脂,乙腈在提取过程中,加入1%乙酸并采用冷冻离心,能很好的减少脂肪和其他杂质的溶出,能减少基质对苯并烯氟菌唑目标物的干扰。由于大豆比较干燥,在乙腈提取前加入适量水浸泡,能更好的提取目标物。QuEChERS方法常用的净化剂有 PSA、C18、GCB等, PSA主要去除有机酸和色素,C18主要去除脂肪,GCB主要去除色素。本研究比较了3种不同净化剂(PSA,C18,GCB各100 mg)对纯溶剂中苯并烯氟菌唑的吸附效果。结果表明GCB对苯并烯氟菌唑有较强的吸附,回收不到50%,PSA和C18对目标物没有吸附,因此本研究选择PSA,C18作为净化剂。为了考察PSA和C18净化效果,本研究对大豆样品提取液进行净化,用量及组合见表2。PSA和C18各100 mg时回收率为68.2%,PSA,C18各200 mg,回收率提升,PSA,C18各300 mg时,回收率变化不大,PSA200 mg和C18各200 mg组合使用时,回收率最高97.6%,满足实验的要求。最终选择PSA和C18各200 mg作为净化剂进行净化。

表2 不同净化剂对大豆中苯并烯氟菌唑的净化效果

表3 方法的平均回收率和精密度(n=6)

2.2 仪器方法的确定

考虑到样品基质中杂质的干扰,为使目标化合物获得较好的峰形和响应强度,降低基质效应的干扰,对下列几种流动相进行比较:A乙腈-10 mmol/L 乙酸铵水溶液 ;B甲醇-1%甲酸水;C乙腈-1%甲酸水,见图1。通过对流动相的考察,发现乙腈-10 mmol/L 乙酸铵水溶液(A)和甲醇-水(B)这两种流动相的色谱图中出现杂质峰。通过响应强度比较,乙腈-水(C)流动相中苯并烯氟菌唑的响应强度最高,峰型更好,乙腈-水(C)出峰时间比乙腈-10 mmol/L 乙酸铵水溶液(A) 和 甲醇-1%甲酸水(B)出峰时间稍晚,综合峰形和响应强度情况,最终选择乙腈-1%甲酸水作为流动相。

注:a乙腈-10 mmol/L 乙酸铵水溶液;b甲醇-1%甲酸水;c乙腈-1%甲酸水。图1 3种不同流动相苯并烯氟菌唑的色谱图

苯并烯氟菌唑分子式中含有2个氟、2个氯的卤代基,在电离过程中,分子中易失去氢质子,形成负离子,所以本方法在电喷雾离子源(ESI)下采用负离子模式进行扫描,选择多反应监测模式进行分析。首先对目标物进行一级质谱分析,确定目标物的母离子,在MS2 SIM扫描模式下优化毛细管出口电压(Fragmentor)参数,按照优化的参数进行二级质谱分析,通过Product Ion扫描模式进行分析,选取信号最强的两个子离子,通过MRM扫描模式进一步优化,确定为各自的定量参数(见表1)。按照上述优化的前处理参数和仪器参数进行实验。

3 方法性能学考察

3.1 基质效应

在选用质谱进行样品分析时,会存在基质效应(ME)问题。空白基质配制的标准曲线的斜率与溶剂配制的标准曲线的斜率相比,当比值大于1,表现为基质增强效应,当比值小于1,表现为基质抑制效应[21]。通常采用同一样品的空白基质配制曲线进行校正定量,或者选用稳定同位素内标法等方法减少基质效应的干扰[22]。本方法选择空白大豆基质,用该空白基质溶液和纯试剂乙腈分别配制一定梯度浓度的标准曲线,斜率比值为0.74,说明苯并烯氟菌唑在大豆基质中存在抑制效应,本研究为降低基质效应的影响,选用相应的大豆空白基质配制曲线。

3.2 方法的线性关系及灵敏度

在空白大豆基质中,分别添加10、20、50、100、200 μg/kg梯度水平制作基质曲线,苯并烯氟菌唑曲线的线性关系良好,R2大于0.99,以3倍信噪比定为苯并烯氟菌唑的检出限,检出限为4 μg/kg,以10倍信噪比定为苯并烯氟菌唑的定量限,定量限为10 μg/kg, 在10～200 μg/kg范围内,线性关系良好,线性方程为Y=4 360 822X-2 704、相关系数R2为0.998 9。

3.3 方法的准确度和精密度

在空白大豆样品,分别添加10 、20 、50 μg/kg 3个浓度水平,每个浓度进行6个平行实验,苯并烯氟菌唑的回收率在73.6%～91.7%范围内,变异系数在4.7%～10.9%范围内。检测结果见表4,其结果符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的相关要求。

3.4 实际样品分析

为了解市场大豆中苯并烯氟菌唑残留情况,从5个超市,6个菜市场购买30批次大豆样品,按照本研究建立的检测方法进行样品处理检测,该30批次大豆样品中均未检测出(低于定量限)苯并烯氟菌唑。

4 结论

本研究采用QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)方法进行样品提取、净化,经C18色谱柱分离,以乙腈和0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱,选择负离子多反应监测模式检测,优化了色谱及质谱参数,外标法定量,建立了LC-MS/MS法测定大豆中苯并烯氟菌唑的测定方法。该方法的回收率、精密度、线性、测定低限等均满足相关标准的技术要求,适用于大豆中苯并烯氟菌唑的快速检测。该研究方法优点是QuEChERS方法检测效率高,酸性乙腈提取效率高,LC-MS/MS检测灵敏度高,便于对大批量大豆中苯并烯氟菌唑进行定量检测。食品安全国家标准GB 2763—2021中规定了大豆的限量值,但没有相关的检测标准,该方法的建立可以为建立相关标准提供数据参考,同时也可以为相关执法部门提供技术支撑,从而保障进出口大豆的质量安全。