EBP50、p16、LMW-PTP 及Ki-67 在宫颈鳞状上皮内病变中的表达及临床意义

谷秀娟，苟江倩，郑以秀

深圳厚德医院妇科，广东深圳 518110

宫颈癌是一种较常见的恶性肿瘤，病死率在各种妇科恶性肿瘤中居于第2 位，仅次于乳腺癌，据相关数据统计得知，在全球当中，每年新增宫颈癌人数为50 万例，其中，我国患病占比达1/4[1]。宫颈鳞状上皮内病变（cervical squamous intraepithelial lesion, CIN）实际就是宫颈癌癌前病变，当前，临床其划分成3 个等级，即CINⅠ（有着较低癌变可能性并且属于自限性病变）与有着较高危险性且可能转变为癌的CINⅡ、Ⅲ[2]。其中CINⅠ属于低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL），CINⅡ、Ⅲ属于高级别鳞状上皮内病变（highgrade squamous intraepithelial lesion, HSIL）。需指出的是，做到对CIN 的及时且准确诊治，对于降低宫颈癌发病、病死率十分关键，尤其是CINⅡ、Ⅲ病变者。有报道强调，在宫颈病变进展当中，磷酸化蛋白50（ERM-binding phosphoprotein, EBP50）、Ki-67、p16、低分子量酪氨酸磷酸酶（low molecular weight protein tyrosine phosphatases, LMW-PTP）均为可靠标志物，与增殖细胞之间存在紧密联系，且增殖指数的高低密切相关于肿瘤的分化程度、浸润、转移、预后等[3]。为证实此类指标在CIN 中的表达情况及临床意义，选取2020 年1 月—2023 年6 月深圳厚德医院收治的62 例宫颈鳞状上皮内病变（squamous intraepithelial lesion, SIL）患者及同时期62 例宫颈健康者为研究对象，采集其宫颈组织，检测其中EBP50、Ki-67 等的表达情况并分析其价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院收治的62 例宫颈SIL 患者及同期62例宫颈健康的健康体检者为研究对象。宫颈SIL 患者年龄25～35 岁，平均（29.62±2.79）岁；体质指数19～32 kg/m2，平均（25.94±1.32）kg/m2；经宫颈活检或手术切除获取宫颈组织，共62 份，其中LSIL 18 份，HSIL 44 份。健康体检者年龄25～35 岁，平均（29.60±2.75）岁；体质指数20～31 kg/m2，平均（25.91±1.35）kg/m2；采集其正常宫颈组织，共62 份。两组研究对象一般资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。患者及其家属均知情同意，本研究经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 方法

两组标本都采用中性福尔马林（10%）进行固定，且实施组织脱水及石蜡包埋。

①试剂。选用产自Abcam 公司的兔抗人EBP50 单克隆抗体，及购自美国Santa Cuze 公司的LMW-PTP 单克隆抗体；采用购自福州迈新公司的小鼠抗人 p16、Ki-67 单克隆抗体及免疫显色试剂。②免疫组化检测EBP50、LMW-PTP、p16 与Ki-67 表达。石蜡切片脱蜡至水，采用H2O2甲醇溶液（3%）将内源性过氧化物酶阻断，以微波热处理方法对抗原进行修复，后分别将Ki-67（1 ∶ 100）、p16（1 ∶100）、EBP50（1 ∶ 200）、LMW-PTP（1 ∶ 200）抗体加入，待孵育过夜后（4℃），将免疫显色试剂加入，在特定温度下（37℃）再孵育30 min。滴加二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色液，并且用苏木精进行复染，然后对切片进行脱水、封固处理。鳞酸盐缓冲液代替一抗，作为阴性对照。

1.3 观察指标

①EBP50。EBP50 蛋白表达于细胞质、细胞核。参照临床病理特征的相似性，把EBP50 阴性与弱染色明确为低表达，而将中、强染色当作高表达。②p16。p16 阳性染色实际就是鳞状上皮下1/2，或者是超过下1/2，有连续弥漫性的细胞质与细胞核染色出现；而p16 局灶斑点状上皮染色或者完全不染色，即阴性表达。③Ki-67。Ki-67 的核染色多出现副基底层，而且阳性细胞数＜30%，即阴性表达；若超出副基底层以上且有细胞核染色出现，同时阳性细胞数≥30%，即阳性表达。④LMW-PTP[4]。参照细胞阳性着色程度（抗原含量）：0 分为阴性，1 分为弱阳性，2 分为中等阳性，3 分为强阳性；根据阳性细胞数量：无阳性细胞为0 分，阳性细胞数为0～＜10%为1 分，10%～＜50%之间为2 分，50%～80%为3分，＞80%为4 分；以积分综合计量，总积分=着色强度×着色细胞数，阴性表达：0 分，低表达：1～4 分，高表达：＞4 分。

1.4 统计方法

使用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析。计数资料用例数（n）和率（%）表示，组间及组内比较用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIL 患者宫颈组织与正常宫颈组织中EBP50、LMW-PTP、p16、Ki-67 表达对比

SIL 患者宫颈组织中EBP50、LMW-PTP 表达低于正常宫颈组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；SIL患者宫颈组织中Ki-67、p16 的表达高于正常宫颈组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 HSIL 与LSIL 患者宫颈组织中EBP50、LMWPTP、p16、Ki-67 表达对比

HSIL 患者宫颈组织中EBP50、LMW-PTP 的高表达率低于LSIL 患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。HSIL 患者宫颈组织中p16、Ki-67 表达阳性率高于LSIL 患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

SIL 实为一种与子宫颈浸润癌紧密相关的一组子宫颈病变，以25～35 岁妇女最为多发。大多数LSIL 可自然消退，但HSIL 具有癌变潜能。需指出的是，通过对宫颈SIL 实施病理诊断，对于阻滞宫颈SIL 转变或进展为浸润性宫颈癌十分关键。近年来，有报道指出，在肿瘤发生、进展中，EBP50、LMW-PTP 起到关键性作用。在诸如食道癌、大肠癌、胆管癌等肿瘤中，EBP50、LMW-PTP 的表达显著减少，而且还密切相关于肿瘤的T 分期、分化程度与淋巴结转移[5]；但需指出的是，有关其在宫颈SIL 当中的表达情况，少有报道。虽然在宫颈癌变当中p16 联合Ki-67 进行检测对HSIL 检测率的提高有利，但EBP50、LMW-PTP 与p16、Ki-67之间的相关性报道并不多。本文以免疫组化方式就EBP50、LMW-PTP 与p16、Ki-67 在宫颈SIL 患者宫颈组织与正常宫颈组织中的表达情况进行对比，且剖析其在宫颈SIL 患者宫颈组织当中表达的相关性，从中明确此类指标的表达情况及临床诊断意义。

近年来，宫颈癌患者人数呈现逐年快速增多趋势。LSIL 能够自行消退，但HSIL 容易进展为浸润性癌。有研究发现，在患者临床治疗中，SIL 分级的病理诊断尤为重要[6]。故在宫颈病变临床诊治中，找寻一些生物标志物来对SIL 实施辅助诊断，十分必要。针对EBP50 而言，其实为一种由两个处于串联状态的PDZ 结构域构成，积极参与到蛋白质间的相互作用当中。本研究发现，在正常宫颈组织当中，EBP50、LMW-PTP 均有较高的表达率，而在宫颈SIL 患者宫颈组织当中，则表达率明显下降（P＜0.05）；另外，其在LSIL 当中的高表达较HSIL 高（P＜0.05）。表明在宫颈SIL 患者宫颈组织当中，EBP50、LMW-PTP 可能丧失保护宫颈鳞状上皮的作用。p16 为一种典型的细胞周期调节蛋白，不仅能抑制细胞生长，而且还能抑制肿瘤的生物学活性。有学者指出，在正常的宫颈鳞状上皮当中，p16偶尔有局灶阳性或者完全缺失[7]。HPV E7 蛋白会对视网膜母细胞瘤蛋白进行抑制，造成子宫颈细胞大量增殖及p16 蛋白的不断积聚，故p16 有助于宫颈疾病诊断准确性的提高。有研究发现，HPV E6/E7m RNA 高表达实为子宫颈癌变的一个关键标志[8]。HPV16 病毒所分泌的癌蛋白E6，能够以一种PDZ 依赖方式与EBP50 相结合，加速EBP50 的降解。E7 能够借助CDK1/2 对EBP50 进行诱导，使其不断磷酸化，因而会加速E6 结合及对EBP50 进行降解。LMW-PTP 能够加速肿瘤的发生与转移，并且与膜细胞骨架结合蛋白埃兹蛋白之间能够相互作用，从而参与肿瘤的形成、转移当中。有研究发现，LMW-PTP 等溶酶体酶在乳腺癌当中能够以胞吐作用的方式对细胞进行破坏，引发肿瘤，且升高LMW-PTP 的活性[9]。本研究得知，在宫颈SIL 患者宫颈组织中，p16 的阳性率自LSIL 到HSIL 有明显上升（P＜0.05），表明p16 对SIL 的分级识别有利。多数LSIL 患者的EBP50、LMW-PTP 呈高表达，p16呈现为阴性表达；而在HSIL 患者当中，多数p16（93.55%）为阳性，而EBP50（22.58%）、LMW-PTP（19.35%）呈低表达。与高娜等[10]研究中HSIL 患者宫颈组织中多数p16（91.19%）为阳性，而EBP50、LMW-PTP 呈低表达的结果具有一致性。对于Ki-67，其实为一种细胞增殖指标，同时还是一种在增殖细胞当中表达的核抗原。需指出的是，除了静止期之外，其在细胞周期的全部阶段都有表达。Ki-67 染色能够对SIL 进展进行预测，在此方面较标准的组织病理学分级优。本研究得知，LSIL 患者宫颈组织中Ki-67 的阳性率较低，而在HSIL 患者宫颈组织中则较高，提示Ki-67 在LSIL 患者宫颈组织中的阳性率较HSIL 低（P＜0.05）。p16、Ki-67 相对应的免疫组化结果实为对HSIL、LSIL 实施病理诊断的关键参考指标[11-12]。

综上所述，EBP50、LMW-PTP 表达在正常宫颈组织当中，多为高表达，而在宫颈SIL 患者宫颈组织当中多为低表达；Ki-67、p16 的表达都伴随SIL 级别的增加而随之升高，而EBP50、LMW-PTP 与SIL 级别呈负相关。对此，推测EBP50、LMW-PTP 可用于SIL 的早期诊断，可作为其免疫标志物。