基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法定性分析啤酒中的β-葡聚糖

化敬言

（厦门大学，福建 厦门 361005）

1 前言

啤酒是一种以麦芽、啤酒花、水和酵母为原料，经过液态糊化和糖化，再经过液态发酵酿制而成的酒精饮料。啤酒的历史可以追溯到美索不达米亚文明，因为其营养价值高、口感好，啤酒已成为世界上消费最多的酒精饮料之一。

在酿造啤酒的过程中，麦芽汁中的淀粉类物质会在淀粉酶的作用下水解，形成葡聚糖和其他副产物。其中，β-葡聚糖是最主要的一种，它是由许多葡萄糖分子通过β-糖苷键连接而成的线性高分子。β-葡聚糖对啤酒的质量具有比较突出的影响，包括优化啤酒的口感和泡沫的稳定性与挂杯性等。人体可以轻易地吸收啤酒中的β-葡聚糖，因为β-葡聚糖是一种水溶性多糖，可以很容易地穿过肠道壁，进入血液循环。然而，过量摄入β-葡聚糖可能会导致肠道胀气、腹泻、腹痛等不良反应，因此建议适量饮用啤酒。

β-葡聚糖具有多种检测方法，包括荧光辅助糖电泳法、高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法等。以上方法均有局限性，且不能检测聚合度超过7的寡糖。利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS），可快速分析啤酒中聚合度大于7的糖类。

MALDI-TOF由离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）两部分组成，可以同时测定样品中的多种成分。实验时，将微量样品与过量基质的混合液体点到样品靶上，经加热或风吹干形成共结晶后，把样品靶放入离子源室内。在达到一定真空后，激光照射到靶上的样品，基质从激光中吸收能量传递给样品分子，样品分子瞬间汽化。基质的质子转移给样品分子使其离子化，然后进入飞行时间质量分析器，根据它们各自的质荷比（m/z）进行检测，数据处理后得到质谱图。

离子离开加速区的速度满足。

其中，m表示离子质量，z表示离子所带电荷，U表示加速电场电压。因此，m/z越大的离子飞行的速度越慢，到达检测器的时间越长。

作为一种重要的质谱分析方法，MALDI-TOF MS在聚合物的表征中起到不可或缺的作用，可用于聚合物的数均和重均分子量的测定、分子量分布、重复单元结构确认、端基确定、杂质及添加物的检测等。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

2,5-DHB：色谱纯，日本TCI公司；三氟乙酸：色谱纯，阿拉丁试剂有限公司；雪津啤酒：产于福建省莆田市；乙腈：色谱纯，德国Merck公司；醋酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

2.2 仪器与设备

Autoflex maX MALDI-TOF MS质谱仪；分析天平：XS205型，美国Mettler-Toledo公司；超纯水系统：Milli-Q型，美国Millipore公司；仪器的参数激光源：Nd: YAG激光，采集方法为反射正离子模式。

2.3 样品的前处理

先用超声波将啤酒脱气0.5h，除去啤酒中的气泡，随后用超纯水对啤酒进行稀释。

2.4 基质的制备

在100μL乙腈/水溶液（体积比1:1，含0.1%三氟乙酸）中加入1mg2,5-DHB，涡旋均匀，使其溶解，得到10mg·mL-12,5-DHB基质溶液。在乙腈/水溶液（体积比1:1，含0.1%三氟乙酸）溶解醋酸钠，配制得到浓度为2mg·mL-1醋酸钠溶液。

2.5 点样与MALDI-TOF MS分析条件

点样方式为混合法，即在靶板上，按照顺序依次点上1μL基质溶液、1μL待测样品、1μL醋酸钠溶液，随后用移液枪混合均匀，用吹风机竖直吹干。

用分子泵将真空度降低至1.0×10-6mbar以下，根据样品性质、待测样品的分子量大小等，选择合适的模式，即“RP”模式。调整m/z检测范围与激光能量，通过累加图谱等方式，得到合理的图谱。采样完毕，打开待分析文件。根据图谱中的峰值定性分析。

测试完成，打开入口盖，送出样品靶，把装有样品靶的靶托从样品靶平台取出，把样品靶清洗干净。取另一块干净的靶板，放回仪器样品靶平台上，送回仪器内，并选择方法，使仪器处于待机状态。

3 结果与分析

3.1 葡聚糖对应峰的寻找

在啤酒中，葡聚糖一般是聚合度不高的二糖或寡糖。不同聚合度的葡聚糖之间会相差n个C6H10O5结构单元，因此，可以寻找一组或多组相对分子质量均相差约为162的化合物。当找到不少于4个峰的时候，可证明该组数据可信。

本实验中，可观察到两组葡聚糖。第一组葡聚糖对应的相对分子质量分别为526.937、689.109、851.185、1013.233、1175.292、1337.3651、1499.340，第二组葡聚糖对应的相对分子质量分别为568.934、731.133、893.1731、1055.224、1217.251。谱图中（图1）所有所需的峰对应的m/z已经标出。

图1 以掺有钠离子的2, 5-DHB为基质采集到的啤酒稀释液的MALDI-TOF MS谱图

3.2 葡聚糖聚合度的分析

不考虑端基时，若葡萄糖发生聚合，二糖的相对分子质量为342，三糖的相对分子质量为504。当葡聚糖存在端基时，其相对分子质量一定大于该聚合度下不存在端基的葡聚糖的相对分子质量。本实验中，第一组葡聚糖最低、最高相对分子质量分别为526.937与1499.340，其聚合度分布在3～9；第二组葡聚糖最低、最高相对分子质量分别为568.934与1217.251，其聚合度分布在3～7。

4 讨论

本实验条件有限，未选择各种厂商的啤酒进行测试。同时，若条件允许，可尝试实验条件的优化，如改变啤酒稀释的比例、改变基质的种类与组成以及改变点样方法等。

实验时，需要注意各溶液加入的顺序，并混合均匀。在其他的某些质谱分析实验中，可能会采用基质包裹目标物的点靶方法，因此更需要注意溶液加入的顺序。值得注意的是，寻找目标物时，m/z较低处的区间内峰的情况较为复杂，可从较大的相对分子质量入手，向下寻找低聚合度的葡聚糖。采集数据时，样品点边缘的样品含量一般较高，且明亮处样品含量较高。因此，激光发射点应尽量选择边缘明亮处。

选择合适的物质作为基质时，该物质需要具备特性的物理与化学性质，包括但不限于：可吸收激光能量并把能量转移给分析物，避免过量的能量使分析物裂解；可包埋分析物，避免分析物分子缔合导致的质量复杂化；可通过光激发或光离子化作用把质子转移给分析物，促进分析物分子离子的形成；与待测样品极性相似、溶解度相近，可以形成良好的共结晶体。若目标物为聚合物，可添加金属离子作为助离子化剂。不同的样品中，基质挥发效果不同。使用不同的基质，优化实验条件，可以改善结晶情况，使样品均匀分散并有效解吸电离，增强质谱信号，进而提高分析的灵敏度、分辨率和重复性等。

除了本实验中定性分析β-葡聚糖之外，MALDITOF MS在常规物质检测，如小分子药物，以及多肽、细菌等复杂物质检测方面也有广泛应用。随着研究的深入，MALDI-TOF MS在分析检测中的作用一定会越来越重要。