精氨酸对变异链球菌生物膜及牙骨质再矿化作用的体外研究

王素苹,方立新,陶地豪,张宜爽,郭安迪,刘 飞

1)郑州大学第一附属医院口腔内科 郑州 450052 2)郑州大学口腔医学院 郑州 450052

根面龋是一种发生在牙根面的细菌感染性疾病,发生位置特殊且发病率高,彻底去除龋坏组织和干燥窝洞较困难,治疗难度相对较大,临床上应以病因预防和早期治疗为主。变异链球菌作为主要致龋菌,具有产酸、耐酸和酵解有机物的特点,在根面龋发生发展中扮演着重要角色[1],因此,抑制变异链球菌生物膜的形成可有效预防根面龋的发生。目前根面龋的治疗效果尚不令人满意,如何在其脱矿早期通过再矿化终止龋损、改善预后逐渐受到关注[2-3]。精氨酸是人体必需的氨基酸,也是一种有效的再矿化的成分,主要存在于唾液中[4]。研究[5]发现,精氨酸不仅可被部分口腔细菌代谢利用而产碱,阻止致龋菌产酸和耐酸菌生长,抑制牙菌斑生物膜形成;还能有效促进Ca、P离子在牙体表面沉积,诱导脱矿牙体组织再矿化。因此,本实验观察了不同质量浓度精氨酸处理后变异链球菌生物膜产酸情况及生物膜细菌活性,分析精氨酸对变异链球菌致龋力的影响,并通过建立根面龋模拟口内再矿化过程,进一步分析精氨酸在早期根面龋发生后的治疗效果,以探究精氨酸在根面龋病因预防及早期治疗方面的可行性。

1 材料与方法

1.1 细菌培养和细菌悬液的制备取-80 ℃冻存的变异链球菌ATCC 25175(河南省医药科学院生物与免疫实验室),常规复苏后接种于脑心浸液(brain heart infusion agar,BHI)琼脂培养基中,37 ℃恒温厌氧环境(80%的N2,10%的CO2,10%的H2;均为体积分数)中培养24 h后挑取单克隆菌株,继续培养24 h,制备细菌悬液。用PBS将细菌悬液稀释至1×107CFU/mL,4 ℃保存备用。

1.2 精氨酸溶液的配制及生物膜的形成将精氨酸粉末(北京索莱宝科技有限公司)溶于10.0 g/L的BHI蔗糖液体培养基中,配制成含有5.0、7.5、15.0和30.0 g/L精氨酸的液体培养基,作为实验组,以不加精氨酸的10.0 g/L BHI蔗糖液体培养基作为对照组,121 ℃高压灭菌20 min,备用。

1.3 精氨酸对变异链球菌生物膜产酸及生物膜量的影响

1.3.1生物膜的制备 将实验组和对照组培养基分别加入24孔板中,每组4个复孔,每孔2 mL。每孔加入200 μL变异链球菌悬液,37 ℃恒温厌氧环境过夜,培养形成成熟的变异链球菌生物膜,备用。

1.3.2生物膜产酸的测定 从培养24 h的变异链球菌生物膜培养液中每孔取样1 mL,转移到新的24孔板中,用pH 计(瑞士 Mettler-Toledo公司)测定pH,每组重复测定4次。

1.3.3生物膜量的测定 吸除24孔板中培养液,PBS轻柔漂洗3次,去除生物膜表面浮游细菌及残留培养液。每孔加入100 μL甲醛于室温下固定15 min,PBS冲洗去除甲醛,风干;加入100 μL 1.0 g/L 结晶紫溶液,室温下浸染30 min后吸出,PBS漂洗3遍,风干;加入100 μL冰乙酸溶液,37 ℃孵育30 min。吸取200 μL溶有结晶紫的冰乙酸溶液转移到新的96孔板中,酶标仪测定590 nm处的吸光度,表示各组生物膜量,每组重复测定4次。

1.4 精氨酸对根面龋牙骨质再矿化的影响

1.4.1根面龋模型建立及牙骨质再矿化模拟 收集表面无龋坏的人离体前磨牙48颗,刮除牙周膜及牙石后于釉牙骨质界下2 mm处行冠根分离。用金刚砂片切取4 mm×4 mm×2 mm的牙组织块,碳化硅砂纸流水下磨平、抛光。超声振荡除去碎屑及玷污层,自然干燥后以牙骨质面作为实验区并外涂双层耐酸指甲油保护。将牙骨质块放置于人工酸蚀液中37 ℃脱矿处理96 h,建立早期根面龋模型。取8块不进行脱矿处理的酸蚀牙骨质块作为阴性对照,以不加精氨酸的人工唾液组为对照组,将精氨酸粉末溶于人工唾液中,制备7.5、15.0和30.0 g/L的精氨酸溶液,将已形成根面龋的样本随机分为4组,每组10块。各组样本分别浸泡于人工唾液、7.5、15.0和30.0 g/L的精氨酸溶液中,20 min/d,操作完毕后放回37 ℃人工唾液(每48 h更换一次)中。连续操作20 d,模拟早期根面龋形成后牙骨质在口腔内的再矿化过程。

1.4.2牙骨质表面物理形态的观察 在各组中随机选取4块牙组织,PBS漂洗3次,戊二醛溶液4 ℃避光固定12 h,梯度浓度乙醇脱水,干燥后喷金,扫描电镜(QUANTA FEG 250型,美国FEI公司)下观察牙骨质表面形态。每块牙组织选择 3个位点,采集镜下图片,选取具有代表性的图片,观察牙骨质块表面形貌的区别。

1.4.3牙骨质表面化学元素的构成 在各组再矿化模型中随机选取4个实验模型,用PBS漂洗3次,每个实验模型随机选择3个位点,置于能谱仪下分析各元素的含量。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0分析实验结果,应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组变异链球菌生物膜产酸和生物膜量,以及各组牙骨质表面化学元素含量的差异,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 精氨酸对变异链球菌生物膜产酸和生物膜量的影响见表1。由表1可知,与对照组相比,各实验组pH值均有所升高,且精氨酸质量浓度越高,pH值也越高(P<0.001),说明变异链球菌生物膜在加入精氨酸处理后产酸量下降。与对照组相比,各实验组精氨酸含量越高,生物膜量越少(P<0.001),提示精氨酸对细菌生物膜的形成具有抑制作用。

表1 精氨酸对变异链球菌生物膜产酸和生物膜量的影响

2.2 体外根面龋模型建立见图1。扫描电镜下观察可见,未经人工唾液脱矿前的牙骨质表面较为平坦(图1A),或有少许裂隙(图1B),表面纹路似鱼鳞状(图1C),排列整齐。脱矿后,牙骨质表面呈现镂空疏松结构,胶原纤维交织成复杂网状结构,深部有大量牙本质小管口敞开(图1D);提示根面龋模型构建成功。

A:脱矿前牙骨质表面(×5 000);B:脱矿前牙骨质表面裂隙(×3 000);C:脱矿前鱼鳞状纹路(×2 000);D:脱矿后牙骨质表面疏松结构(×3 000)。

2.3 各组牙骨质表面物理形态的变化见图2。与酸蚀后牙骨质块相比,对照组牙骨质表面形貌改变并不显著(胶原纤维排列均较松散,呈网状,表面可见镂空疏松结构)。7.5 g/L精氨酸组牙骨质块表面可见明显的牙本质小管,牙本质小管口周围未见明显再矿化沉积物质,牙本质小管口敞开;15.0 g/L精氨酸组牙骨质片表面轻微凹陷,电镜下示表面大颗粒状沉积物;30.0 g/L精氨酸组牙骨质片表面平坦,可见大量白色沉积物平铺在牙骨质面,牙本质小管口被大量白色颗粒状沉积物封闭,表面未见明显牙本质小管口敞开与镂空疏松结构。

A:对照组;B:7.5 g/L精氨酸组;C:15.0 g/L精氨酸组;D:30.0 g/L精氨酸组。

2.4 各组牙骨质表面化学元素构成的比较牙骨质表面主要含有Ca、P、Na、O、C等元素,能谱仪下分析各元素的含量如图3和表2所示。各实验组Ca、P含量都有所升高,且精氨酸含量越高,Ca、P含量升高越明显,差异有统计学意义(P<0.05)。

A:未脱矿;B:脱矿后;C:对照组;D:7.5 g/L精氨酸组;E:15.0 g/L精氨酸组;F:30.0 g/L精氨酸组。

表2 各组牙骨质表面化学元素含量比较 %

3 讨论

龋病的发生发展与口腔微生态失衡密切相关,口腔微生态内的酸碱代谢影响着微生物群落的组成及性状,是调控口腔微生态平衡的重要因素。牙菌斑生物膜中的变异链球菌作为主要致龋菌,产酸及耐酸性是其主要的毒力因子和致龋因素,其黏附于牙面形成的生物膜对抗菌药物和免疫系统均具有很强的抵抗力。近年来有学者[6]发现,牙菌斑生物膜中的产碱活动,尤其是精氨酸脱亚胺酶系统参与的精氨酸代谢活动以及尿素酶作用下的尿素水解反应代谢,可以有效调控微生态酸碱平衡,从而有利于龋病防治。

精氨酸作为唾液黏蛋白可吸附于牙齿表面,调节细菌代谢产氨,创造碱性环境,有效抑制变异链球菌生物膜对牙面的黏附。本实验通过向蔗糖培养基中加入不同质量浓度的精氨酸作用于变异链球菌生物膜,并通过检测菌液生长pH值及结晶紫染色法验证精氨酸对生物膜产酸代谢及生成量的影响。结果表明:实验组的生物膜产酸量及细菌总量较对照组显著降低,精氨酸可有效抑制致龋菌产酸及增殖,且精氨酸含量越高,作用效果越明显,这与Vaziriamjad等[7]的研究结果相符。其可能的机制为:①精氨酸能够促进细菌的精氨酸代谢途径。一方面,前期研究[6]证实细菌的精氨酸代谢主要通过精氨酸脱亚胺酶系统进行,终产物为鸟氨酸、氨、二氧化碳和腺苷三磷酸;精氨酸脱亚胺酶系统由一系列酶构成,包括精氨酸脱亚胺酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶和氨基甲酸激酶,随着精氨酸质量浓度的增加,其相应的碱性代谢产物就越多。另一方面,编码精氨酸脱亚胺酶系统的基因通常位于一个操纵子中,环境刺激可调控其表达;在多数口腔细菌中,精氨酸及低pH值可上调精氨酸脱亚胺酶系统相关基因的表达[8]。②精氨酸使变异链球菌gtfB、gtfC基因表达降低,影响葡聚糖的合成后抑制变异链球菌附着,减少菌斑形成而消除致龋环境[9]。③精氨酸的正电荷基团能与牙本质表面的负电荷基团结合,从而提高牙齿表面的pH值[10],在本实验中则可能与精氨酸吸附菌悬液中的负电荷基团有关。

临床上牙骨质龋呈浅碟形,龈下菌斑中的微生物产酸会导致牙体组织脱矿,Ca、P离子从牙骨质表面流失,羟基磷灰石晶体溶解,使矿物质平衡状态紊乱,从而发生龋坏[11]。精氨酸在口腔内主要分布于唾液中,是唾液黏蛋白的一种成分,能够通过唾液黏蛋白的半透膜作用黏附在牙齿表面,并进而调节口腔菌丛的平衡及离子间的动态平衡。精氨酸的羧基和氨基侧链可静电吸引Ca、P离子并通过化学键的作用形成高稳定的精氨酸-Ca-P复合物,促进脱矿牙体组织的再矿化。

因此,本实验通过建立根面龋模型,利用3种不同质量浓度的精氨酸溶液处理以模拟口内再矿化过程,扫描电镜及能谱分析结果表明:经精氨酸处理后的牙骨质表面结构更加紧密,有大块沉积物形成,且Ca、P离子含量升高,提示精氨酸对脱矿牙骨质具有再矿化的效果。可能的作用机制是:精氨酸的正电荷基团可与牙本质表面的负电荷基团结合,吸附Ca、P离子,促进其沉积于牙面和牙本质小管中[8]。但这部分实验仍有不足之处,比如分组情况基于既往文献[12]所用精氨酸质量浓度,缺乏更精细的质量浓度分组,在接下来的工作中应当完善其他质量浓度条件下的再矿化实验,进一步探究再矿化作用机制。

综上所述,本研究初步证实了精氨酸对变异链球菌生物膜有良好的抑制作用,且一定程度上可以有效促进牙骨质再矿化,提示精氨酸在根面龋的预防和早期治疗方面有良好的应用前景。但由于口腔环境的复杂性,仍需要大量的更深入的研究以探讨精氨酸在根面龋临床防治方面的长期效果。