Fas/FasL传导通路研究电针对慢性萎缩性胃炎小鼠的作用机制

王树国 薛晓捷 张春龙

（1.山西省针灸医院针灸四科，山西 太原，030006；2.山西中医药大学针灸推拿学，山西 晋中，030024）

慢性萎缩性胃炎（CAG）是一种常见于脾胃系统的疾病，临床表现主要为胃脘部疼痛。由于CAG在早期时无显著特异的临床症状，使得很多患者在确诊时已处于发病晚期，很多已经进展到早期胃癌，严重影响患者的生活质量[1]。并且CAG的发病周期较长，其发生与发展并不是一蹴而就的，加强早期治疗具有重要价值[2-3]。CAG是由各种因素综合所致的疾病，也与幽门螺杆菌感染、遗传、精神、胆汁反流、环境、饮食习惯等密切相关[4]。CAG在病理上可表现为胃黏膜上皮细胞和腺体萎缩、黏膜苍白，常伴有胃幽门腺化生、不典型增生、肠化生等。西医对于CAG的治疗多采用对症治疗，缺乏特异性，虽然可缓解临床症状，但是长期治疗效果不佳[5-6]。随着中医学的发展，CAG的中医治疗方法在不断改善，其中电针作为一种刺激稳定、效果良好的治疗方法，被广泛地应用于临床中[7]。Fas/FasL系统介导的细胞凋亡信号通路是细胞凋亡的重要途径之一，在细胞凋亡的执行过程发挥重要作用[8]。本文探讨基于Fas/FasL传导通路研究电针对慢性萎缩性胃炎小鼠的作用机制，揭示电针治疗CAG的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级正常雄性C57BL/6小鼠64只，鼠龄6～8周，体质量20～23 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，实验单位为山西赛沐设备有限公司[许可号：SCXK（京）2019-0010]。小鼠居住于固定且安静通风的鼠笼内，每日上午8点至晚上8点进行12 h光照，其余时间黑暗，自由摄食、饮水，室温（24±2）℃，湿度（55±15）%。所有动物适应性饲养1周，消毒及人员进出严格遵循SPF级实验室要求。实验期间，动物的处理均符合动物伦理要求，研究得到了山西省针灸医院实验动物伦理委员会的批准。

1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG）（生产企业：上海麦克林生化科技有限公司，生产批号：C12400671）；10.0%中性缓冲福尔马林固定液（生产企业：南昌雨露实验器材有限公司，生产批号：210610）；SDZ-II型号电针仪[生产企业：苏州医疗用品厂有限公司，生产批号：苏食药监械（准）字2013第2270611号]；华佗牌针灸针[规格：0.25×13 mm，生产批号：津（食）药监械生产许20100138号]；Fas、FasL免疫组化试剂（生产企业：武汉赛维尔生物科技有限公司）。

1.2 动物造模方法

将64只小鼠随机分为对照组10只、造模组54只。对照组小鼠不做处理。造模组小鼠自由饮用浓度配置为100μg/mL的1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍饮用液，给予饥饱交替失常饮食，并每日予以小鼠0.2 mL（10 mL/kg）浓度为40%的乙醇溶液灌服。13周起，随机抽取造模组小鼠，剖杀检测是否造模成功。16周后CAG小鼠模型制作成功，成功造模的证据是在造模小鼠病理切片中出现局部腺体减少或紊乱、间质纤维血管增生以及黏膜下淋巴滤泡形成。同时，剖杀对照组小鼠进行比较。

1.3 动物分组与处理

将已成模的50只CAG小鼠随机分为模型组10只、普通针刺组20只、电针组20只。治疗进行时间均选择上午8:30-11:30，对照组、模型组不予治疗。普通针刺组予以小鼠普通针刺治疗，第一次为针刺中脘穴和左侧足三里穴15 min，左侧足三里出针后再针刺右侧足三里穴15 min，第二次先右侧足三里，后左侧足三里，依次交替取穴，隔日进行一次针刺治疗，共进行8周。电针组予小鼠电针治疗，第一次用电针仪连接中脘和左侧足三里15 min，左侧足三里出针后针刺右侧足三里穴并连接中脘穴和右侧足三里穴15 min，第二次先连接右侧足三里后左侧足三里，依次交替取穴电针治疗，隔日进行一次电针治疗，共进行8周。电针组选用的波形是连续波，波宽为0.1 ms、电流强度为1 mA，刺激频率为10 Hz。在穴位定位中，中脘穴位于小鼠的正中线上耻骨上嵴向上9等分处（小鼠的耻骨至胸骨剑突平均划分为17等分）。足三里穴位于小鼠的膝关节下方，腓骨头下约3 mm处的肌沟中；针刺角度为直刺，进针深度约为5 mm。电针组和普通针刺组小鼠接受治疗干预时，应将其以仰卧位固定于自制鼠台上。故应对对照组和模型组小鼠予以相同的束缚方法固定30 min，以排除应激反应。所有小鼠均治疗观察14 d。

1.4 观察指标

（1）观察并记录小鼠的一般行为情况、毛色状况、活动状况等。同时记录所有小鼠治疗前、治疗14 d后的体质量情况。（2）所有小鼠在治疗前、治疗14 d后抽取空腹尾静脉血50μL左右，静置放置30 min后，以2 000转/min离心10 min，取上层血清保存在-80.0℃冰箱，采用酶联免疫法检测血清白细胞介素（IL）-6、IL-1β含量，检测试剂盒购自武汉三鹰公司。（3）所有小鼠在治疗14 d后采用脊椎脱臼法处死，解剖摘取全胃，将胃腔沿胃大弯剪开，掏出胃内容物并暴露内侧面，用生理盐水冲洗后迅速切取胃组织，将胃黏膜组织分为3份。1份放入10.0%中性缓冲福尔马林固定液中，存放24 h以上，然后进行病理染色分析，胃黏膜组织固定后进行冲洗、梯度脱水并进行石蜡包埋，常规切片，进行HE染色，二甲苯脱蜡后采用梯度浓度乙醇进行脱水并冲洗，苏木素-伊红浸染，冲片、干燥。使用显微镜采集镜下胃黏膜组织形态变化并进行评分，包括炎性反应、腺体减少、肠化情况等，分为0～3分，分数越高代表病理状况越差。（4）取上述胃黏膜组织，采用免疫组化的方法检测小鼠Fas蛋白、FasL蛋白表达水平，以相对表达水平进行记录。

1.5 统计学分析

采用SPSS 25.0统计学软件分析数据，计量资料采用（）表示，两两对比给予LSD检验；计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，多组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠的一般情况

对照组：小鼠毛色润泽光亮，饮食量正常，抓取小鼠时挣扎有力，活动灵巧。

模型组：大便时有偏稀，进食量明显减少，小鼠毛色粗糙暗淡，不喜动作。

普通针刺组、电针组：小鼠饮食量有所增加，精神状况好转，毛色开始转变为光亮。

2.2 四组小鼠治疗前后的体质量变化比较

治疗前普通针刺组、电针组、模型组的体质量都显著低于对照组（P＜0.05），治疗14 d后普通针刺组、电针组的体质量高于模型组（P＜0.05），电针组治疗14 d后的体质量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）,见表1。

表1 四组小鼠治疗前后的体质量变化比较 （ ，g）

表1 四组小鼠治疗前后的体质量变化比较 （ ，g）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与普通针刺组比较，③P＜0.05，下同。

组别只数治疗前治疗14 d后对照组1038.48±2.1943.48±2.24模型组10 32.11±1.58① 32.14±2.09①普通针刺组20 32.17±1.17① 38.68±2.73①②电针组20 32.43±0.85① 43.10±1.48②③F 11.184 15.793 P＜0.001＜0.001

2.3 四组小鼠治疗前后的血清IL-6、IL-1β含量变化比较

治疗前普通针刺组、电针组、模型组的血清IL-6、IL-1β含量都高于对照组（P＜0.05），治疗14 d后普通针刺组、电针组的血清IL-6、IL-1β含量低于模型组（P＜0.05），电针组治疗14 d后的血清IL-6、IL-1β含量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 四组小鼠治疗前后的血清IL-6、IL-1β含量变化比较（，pg/mL）

表2 四组小鼠治疗前后的血清IL-6、IL-1β含量变化比较（，pg/mL）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与普通针刺组比较，③P＜0.05，下同。

IL-1β治疗前治疗14 d后治疗前治疗14 d后对照组102.57±0.262.51±0.323.11±0.253.06±0.44模型组1013.82±0.77①15.60±1.14①12.01±0.27①13.78±0.25①普通针刺组2013.46±1.13①8.48±0.57①②12.15±0.28①7.84±0.47①②电针组2013.58±1.26①2.57±0.25②③12.33±1.74①3.26±0.28②③F 45.111 49.245 37.794 41.117 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001组别只数IL-6

2.3 四组小鼠治疗14 d后的胃黏膜组织病理形态评分比较

治疗14 d后普通针刺组、电针组、对照组的胃黏膜组织病理形态评分都低于模型组（P＜0.05），电针组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 四组小鼠治疗14 d后的胃黏膜组织病理形态评分比较 （ ，分）

表3 四组小鼠治疗14 d后的胃黏膜组织病理形态评分比较 （ ，分）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与普通针刺组比较，③P＜0.05，下同。

组别只数炎症腺体减少肠化情况对照组100.32±0.010.26±0.030.28±0.02模型组10 2.33±0.48① 2.34±0.27① 2.41±0.28①普通针刺组20 1.48±0.36①② 1.33±0.27①② 1.57±0.32①②电针组20 0.35±0.04②③ 0.28±0.02②③ 0.29±0.03②③F 43.595 51.104 54.687 P＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 四组小鼠治疗14 d后的胃黏膜组织Fas蛋白、FasL蛋白表达水平比较

治疗14 d后普通针刺组、电针组、对照组的黏膜组织Fas蛋白、FasL蛋白相对表达水平低于模型组（P＜0.05），电针组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表4、图1、图2。

图1 四组小鼠治疗14 d后的胃黏膜组织Fas蛋白表达情况

图2 四组小鼠治疗14 d后的胃黏膜组织FasL蛋白表达情况（比例尺为×200）

表4 四组小鼠治疗14 d后的胃黏膜组织Fas蛋白、FasL蛋白相对表达水平比较 （ ）

表4 四组小鼠治疗14 d后的胃黏膜组织Fas蛋白、FasL蛋白相对表达水平比较 （ ）

组别只数Fas蛋白FasL蛋白对照组101.03±0.141.06±0.24模型组10 5.40±0.54① 5.79±0.35①普通针刺组20 3.49±0.46①② 4.10±0.57①②电针组20 1.12±0.14②③ 1.23±0.17②③F 38.69641.114 P＜0.001＜0.001

3 讨论

正常胃黏膜对盐酸及消化性损伤具有显著抗拒性，胃黏膜的防御因子、攻击因子失衡可导致胃黏膜受损，从而诱发胃炎的发生[9]。西医对CAG的治疗主要为药物治疗和手术治疗，虽然短期内有较好的治疗效果但从长期来看，疗效维持性并不令人满意[10]。随着医学技术的发展，中医学对CAG病机进行了深入的研究，并认为CAG是由于脾胃虚弱，运化失常，气机壅滞，导致邪浊内生，进一步损害脾胃，属于中医“胃脘痛”范畴。CAG归属于胃经，而足三里既是胃的下合穴也是足阳明胃经合穴，故治疗CAG可选足三里穴。中脘穴与胃脉相通，亦是胃之募穴、六腑之会[11]。中脘穴具有调节脾胃升降兼化痰浊等作用[12-13]。本研究显示治疗14 d后普通针刺组、电针组的体质量高于模型组（P＜0.05），电针组治疗14 d后的体质量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗14 d后普通针刺组、电针组的血清IL-6、IL-1β含量低于模型组（P＜0.05），电针组治疗14 d后的血清IL-6、IL-1β含量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明电针在CAG小鼠的应用能抑制血清IL-6、IL-1β的表达，还可促进恢复小鼠的体质量。从机制上分析，电针不仅可疏通经络、畅调气机、扶正祛邪、和血止痛，更可以弥补普通针刺刺激持续性较差的缺点[14]。相关研究表明，电针能通过改善炎性反应、调控细胞增殖凋亡、增加胃黏膜血流量、调节代谢物等方式促进CAG机体的胃黏膜修复，从而有利于机体恢复正常的胃部功能[15-16]。

CAG与胃癌有着密不可分的关系，CAG一旦出现肠化生，其癌变率可在10.0%以上。故而对于预防胃癌的发生，对CAG及肠化与异型增生进行控制及逆转具有重要价值。根据临床表现及体征，CAG以脾胃气阴虚弱为本，毒郁、瘀血、气滞为标[17]。本研究显示，治疗14 d后普通针刺组、电针组、对照组的胃黏膜组织病理形态评分都低于模型组（P＜0.05），电针组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明电针在CAG小鼠的应用能改善病理状况。当前有研究显示，电针处理可抑制全身炎性反应，降低机体的氧化应激反应，有效防止有害物质对胃黏膜的损伤，促进黏膜修复及胃蛋白酶活性恢复，提高胃黏膜保护能力[18]。

CAG的发病是胃黏膜细胞凋亡和增殖失调导致的。细胞调亡是一种受凋亡相关蛋白调节的细胞自杀机制。其中凋亡相关蛋白包括Fas家族、caspase家族和Bcl-2家族等，Bcl-2属于抑制凋亡的因子。而Fas作为肿瘤杀伤因子（TNF）的超家族成员，主要分布于糖基化的细胞表面，作用是促进细胞凋亡。相关研究表明，Fas和FasL因子调控的细胞异常凋亡是导致胃黏膜细胞增殖与凋亡功能失调的主要原因，其中FasL是Fas的配体，一旦结合，就会激活细胞凋亡的信号并进行转导，同时抑制Bcl-2对细胞凋亡的影响[19]。李楠等[20]通过研究表明电针可通过调节胃黏膜细胞中Bcl-2、P53的表达来抑制其凋亡。本研究结果显示，治疗14 d后普通针刺组、电针组、对照组的黏膜组织Fas蛋白、FasL蛋白相对表达水平低于模型组（P＜0.05），电针组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明电针在CAG小鼠的应用能抑制Fas/FasL传导通路的表达，从而抑制胃黏膜细胞凋亡，以达到改善胃黏膜萎缩的目的。不过本研究仅研究了电针对于Fas/FasL信号传导通路的调控，其他相关因子及其对应mRNA的表达仍需要进一步的研究探索。

综上所述，电针在CAG小鼠的应用能介导Fas/FasL传导通路的表达，抑制血清IL-6、IL-1β的表达，还可促进恢复小鼠的体质量，能改善小鼠的胃黏膜病理状况。