miR-15a-5p在乳腺癌耐药与敏感患者中的差异分析及耐药价值预测

王志伟, 杜翰林, 王玉洁, 李鸿涛

(新疆医科大学附属肿瘤医院, 乌鲁木齐 830011)

乳腺癌是当前全球女性发病率最高的恶性肿瘤,其较差的预后通常和复发转移有重大关系。乳腺癌目前的治疗手段主要是外科手术治疗辅以化疗、放疗和内分泌治疗的综合疗法[1]。miRNA能通过参与调节下游靶基因翻译过程来发挥其生物学功能,miRNA可以靶向多种增殖相关基因和通路。近几年发现乳腺癌的化疗耐药性在乳腺癌的复发转移中起重要作用。miR-15a-5p是一种肿瘤抑制因子,在多发性骨髓瘤中,miR-15a-5p参与了外泌体相关的miRNA的耐药[2]。目前,在医学界普遍认为,耐药是由多基因、多因素共同作用导致的,与DNA的损伤修复机制、机体免疫密切相关。有研究发现,miR-15a-5p被证实通过抑制组蛋白乙酰化抑制肺癌的转移[3]。本研究通过生物信息挖掘分析miR-15a-5p在乳腺癌细胞中的表达差异并验证其与乳腺癌化疗耐药之间的关系。

1 资料和方法

1.1 资料来源收集2019年1月至2020年1月在新疆医科大学附属肿瘤医院治疗的30例对多西他赛耐药的乳腺癌患者为耐药组,收集同期治疗的30例对化疗药物敏感的乳腺癌患者为敏感组,两组患者一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。所有患者均进行手术治疗,术后进行免疫组化分析,检测患者雌激素受体、孕激素受体等指标表达情况。分析miR-15a-5p与临床病理特征的相关性。本研究获得本院伦理审核批准(K-2021076),所有患者均已签署组织样本研究许可书。

1.2 研究方法

1.2.1 获取数据库资料 肿瘤基因组图谱数据库(TCGA) 计划是由美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)和国家人类基因组研究协会(National Human Genome Research Institute)于 2006 年联合启动的项目,目前共计研究 36 种癌症类型。TCGA利用大规模测序为主的基因组分析技术,通过收集整理癌症相关的各种组学数据,提供了一个大型的免费癌症研究参考数据库,提高人们对癌症发病分子基础的科学认识,提高诊断、治疗和预防癌症的能力,最终完成一套完整的与所有癌症基因组改变相关的图谱[3],分析miR-15a-5p 在各类肿瘤中的表达水平,包括对乳腺癌肿瘤组织和正常乳腺组织的分析,初步判断miR-15a-5p 在乳腺癌及不同分型中的表达水平高低。

1.2.2 q-PCR检测乳腺癌组织中miR-15a-5p的表达水平 取两组患者穿刺标本3条,每条长约1.0～3.0 cm,置于EP管中,保存于液氮中备用。用液氮研磨组织样品,每50～80 mg组织加入1 mL Trizol,匀浆,加入200 mL(1/5体积)的氯仿和75%的乙醇提取RNA,150 V,15 min凝胶电泳观察RNA浓度和纯度,将质量合格的mRNA逆转录cDNA,采用q-PCR检测miR-15a-5p的表达水平。以U6为内参对照,计算2-ΔΔCt为基因表达水平。

1.3 纳入与排除标准纳入标准:(1)筛选新辅助化疗前的乳腺癌患者,化疗后进行手术,根据Miller-Payne分级系统,将1～2级患者评定为耐药组,3～4级患者评定为敏感组;(2)患者接受手术治疗与化疗,并通过手术病理确诊为乳腺癌;(3)临床资料完整;(4)患者年龄≥18岁;(5)患者既往无恶性肿瘤病史。排除标准:(1) 肝肾功能严重不全伴有严重心肺基础疾病者;(2)合并有其他恶性肿瘤者。

2 结果

2.1 各类肿瘤组织中miR-15a-5p表达情况在TCGA数据库中共检索得到33个不同类型的恶性肿瘤,对比癌组织和癌旁组织中miR-15a-5p的表达水平(图 1),其中 miR-15a-5p在15种肿瘤组织中呈高表达,分别为膀胱癌、乳腺癌、宫颈鳞癌、结肠癌、食管癌、头颈癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肝癌、肺腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、甲状腺癌、子宫内膜样癌;在4种肿瘤组织中miR-15a-5p呈低表达,主要为肺鳞状细胞癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤。

2.2 乳腺癌组织样本中miR-15a-5p的表达情况q-PCR检测结果显示,与敏感组(1.390±0.481)相比,耐药组的肿瘤组织中miR-15a-5p表达水平(0.696±0.344)明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 miR-15a-5p在乳腺癌和其他肿瘤组织中的表达差异

2.3 乳腺癌患者中miR-15a-5p表达与临床病理特征的关系q-PCR检测结果显示,乳腺癌组织中miR-15a-5p在ER阳性者中的表达明显低于ER阴性者[(0.836±0.562)vs(1.249±0.449),Z=2.026,P=0.043)];PR阳性者的表达水平明显低于PR阴性者[(0.562±0.162)vs(1.256±0.513),t=3.71,P=0.001)];肿瘤直径≤2 cm者与直径>2 cm者差异无统计学意义[(0.099±0.091 8)vs(1.048 5±0.576),Z=0.120,P=0.904)];组织学分级Ⅰ～Ⅱ级者与组织学分级Ⅲ级者差异无统计学意义[(1.017±0.606)vs(1.113±0.334),Z=0.607,P=0.544];淋巴转移N0～N1者与淋巴转移N2～N3者差异无统计学意义[(1.029±0.528)vs(1.068±0.597),t=0.17,P=0.866)];年龄≤50岁者与年龄>50岁者差异无统计学意义[(1.035±0.588)vs(1.058±0.471),Z=0.027,P=0.98)]。

对60例患者均进行手术治疗,术后对癌组织进行免疫组织化学染色,检测患者雌激素受体、孕激素受体、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移情况等指标与乳腺癌病理特征的关系,结果见表1。

表1 miR-15a-5p表达与乳腺癌病理特征的关系/例(%)

2.4 通过miR-15a-5p表达水平预测乳腺癌患者多西他赛耐药的ROC曲线分析通过miR-15a-5p表达水平预测患者化疗敏感度的曲线下面积(AUC)为0.876,95%置信区间为0.743～1.000,敏感度为0.923,特异度为0.692,具有一定的诊断意义,见图2。

图2 miR-15a-5p预测乳腺癌多西他赛耐药的ROC曲线分析

3 讨论

乳腺癌的治疗手段包括手术、化疗、内分泌治疗及靶向治疗,对晚期患者主要是采取化疗+手术的联合治疗方式,影响晚期患者预后重要影响因素之一是化疗耐药。miRNA能通过参与调节下游靶基因翻译过程来发挥其生物学功能,乳腺癌的化疗耐药性在乳腺癌的复发转移中起重要作用。

化疗是乳腺癌治疗环节中的重要一环,术前化疗目的在于缩小肿瘤体积争取保乳手术,术后化疗旨在降低复发率,应用于晚期乳腺癌患者,可为无法手术治愈的患者延长生存期,并可提高其生活质量。随着近年来对化疗药物的不断研究,乳腺癌患者的生存时间已大幅度提升,但部分患者对化疗药物的不敏感导致生存时间低于预期值。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。有研究发现,miRNA突变或异常表达可能与肿瘤的发生发展密切相关,可发挥促癌或抑癌作用[4]。

miR-15a-5p被指出可能与乳腺癌的迁徙转移相关[8]。本研究通过q-PCR检测乳腺癌化疗耐药组患者和敏感组患者miR-15a-5p的表达差异,结果显示在耐药组中miR-15a-5p的表达明显降低,且通过ROC曲线分析,表明miR-15a-5p表达与乳腺癌患者多西他赛耐药相关,为预测乳腺癌化疗耐药和预后提供了一种假说[5-7]。通过对miR-15a-5p表达水平与肿瘤细胞免疫组化分析,本研究发现miR-15a-5p过表达者的ER、PR表达明显低于低表达者,而miR-15a-5p低表达者的ER、PR表达水平则明显上升,说明化疗耐药的miR-15a-5p低表达的乳腺癌患者可能对内分泌治疗更加敏感。

miR-15a-5p是miR-15a家族中的一员,对乳腺癌的增殖、转移、侵袭具有负调控作用。研究发现,其高表达可靶向诱导乳腺癌细胞凋亡[9-10]。miR-15a-5p的异常低表达降低了B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的促凋亡活性[11],使乳腺癌细胞的抗凋亡能力提升,导致化疗药物治疗失败。miR-15a-5p下游靶向调控PI3K/AKT信号通路[12],AKT是一种原癌基因。Miricescu等[13]研究证实,干扰miR-15a-5p的表达,乳腺癌细胞PI3K/AKT信号通路会明显高表达,提示miR-15a-5p可能与肿瘤细胞的糖代谢相关[14]。随着研究深入,miR-15a-5p可能将成为改变耐药结局的潜在靶点。