基于表型探讨76 份沙芦草核心种质构建策略

张 婷 闫伟红 李志勇 田青松 张冬梅 王永刚

（1 中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特 010010；2 黑龙江省农业科学院草业研究所，哈尔滨 150086；3 内蒙古太仆寺旗红旗镇综合保障和技术推广中心，锡林郭勒 026000）

沙芦草（Agropyronmongolicum），又称蒙古冰草，为禾本科（Poaceae）冰草属（AgropyronGaertn）二倍体多年生草本植物，属于小麦族的野生近缘种[1-2]，是生态建设和饲草生产中重要的乡土牧草，有抗旱、耐风沙、耐贫瘠、抗寒和耐盐碱等优良性状[3-4]，在沙地植被中为优势种，因而近几年常被用于围栏荒漠草原治理[5-6]；沙芦草广泛分布于我国河北、山西、陕西、宁夏、甘肃、内蒙古等地区，尤其在内蒙古的分布十分广泛[1-3]。目前，沙芦草已被列为国家二级珍稀濒危植物和亟需保护的农作物野生近缘种[7]，但是对沙芦草的系统化收集整理及精准鉴定评价工作还比较滞后。

核心种质的概念最早是由Frankel 等[8]提出的，是以最少数量的遗传资源最大限度地保存整个资源群体的遗传多样性。目前已经在许多植物上应用，如玉米[9]、桑树[10]、野生黄花苜蓿[11]、菠菜[12]等。于秀明等[11]利用70 份新疆野生黄花苜蓿种质的19 个表型性状构建新疆野生黄花苜蓿核心种质，郑福顺等[13]基于前期调查的480 份番茄种质资源的20 个表型性状数据，最终确定了“马氏距离+抽样比例为15%+偏离度取样法+离差平方和法”为番茄核心种质最优构建策略。

表型差异是种质筛选的重要依据。沙芦草具有极为丰富的遗传多样性，遗传差异主要来自于居群内个体之间[14-15]，其表型变异类型丰富[16]，同时沙芦草种群间、种群内表型性状差异大[17-18]，且生境变化对表型影响显著[19-20]。目前，对沙芦草的表型多样性研究有一定的进展，而对沙芦草基于表型性状构建核心种质方面还未有相关报道。

综上所述，为了调查、收集、保护沙芦草核心种质资源，本研究收集整理了国家北方饲草种质资源中期库库存以及在内蒙古野外采集的76 份材料，种植于多年生饲草种质资源圃，鉴定评价表型性状，筛选初级核心种质，探讨构建策略，以期为沙芦草的搜集、评价和利用提供理论依据和基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料76 份沙芦草种质资源见表1。供试沙芦草种植于中国农业科学院草原研究所沙尔沁试验基地，位于40°35′N，111°47′E，海拔1060m，土壤pH 为8.2～9.0，有机质含量0.6%，含碳量0.928%，含氮量0.035%，含磷量0.65%，含硫量0.004%，属大陆性半干旱气候，干旱、寒冷、多风沙。年极端高温37.3℃，年极端低温-32.8℃。无霜期130d 左右，年平均降水量350mm，土壤类型为沙质土。

表1 76 份沙芦草收集整理名录

1.2 表型指标测定于沙芦草抽穗期—完熟期，根据《沙芦草种质资源描述规范和数据标准》对76 份沙芦草的表型，包括小穗长、小穗宽、小穗含小花数、穗轴第1 节间长、叶鞘长度、第一颖长、第一颖宽、第一颖脉数、第二颖长、第二颖宽、第二颖脉数、外稃长、外稃宽、外稃芒长、垂直株高、茎粗、倒二叶长、倒二叶宽、旗叶长、旗叶宽、旗叶至穗基部长、穗下第1节间长、穗长、穗宽、小穗数、叶层高度等26 个性状进行观察记录和数据测定。

1.3 表型多样性数量性状依均值和标准差分级，进行质量化处理；各性状的遗传多样性采用Shannon′s 信息指数（H′）进行评价，计算公式为H′=-ΣPilnPi，Pi表示第i种变异出现的频率，用所有相应的各个性状H′的平均值表示一组或所有种质的遗传多样性程度[11]。

1.4 构建初级核心种质的策略

1.4.1 构建方法筛选以25%取样比例进行构建方法的筛选[21]，采用2 种遗传距离（欧氏距离、马氏距离）、3 种取样方法（多次聚类随机取样法、多次聚类偏离度取样法、多次聚类优先取样法）、8 种系统聚类方法（最短距离法、最长距离法、中间距离法、重心法、类平均法、可变类平均法、可变法、离差平方和法）共构建了48 组核心种质候选群体。对不同的方法进行对比，并根据均值差异百分率（MD）、方差差异百分率（VD）、极差符合率（CR）和变异系数变化率（VR）4 个参数检验各取样策略的优劣[9-10]，选出最佳取样和聚类方法。评价标准为MD＜20%且CR＞80%时，初级核心种质的代表性较好，MD 值越小且CR、VD 和VR 值越大，初级核心种质的代表性越强[22]。

1.4.2 总体取样比例的筛选基于最佳取样和聚类方法，分别按照10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%共7 种取样比例构建出7 个核心种质，通过比较各核心种质与原种质的评价参数来确定最佳的取样比例[23]。

1.5 初级核心种质评价及验证对已构建完成的沙芦草初级核心种质进行评价，对原群体和核心种质表型性状均值间是否有显著性差异进行检验，利用方差F 检验分析两者表型性状变异的同质性，并基于主成分分析对最优核心种质的有效性进行验证[24]。

1.6 数据处理采用Excel 2010 软件分析处理各个性状的平均值、极值、变异系数及多样性指数；用QGAstation 2.0 软件进行核心种质相关数据的处理与分析；利用SPSS 26.0 进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 表型多样性分析76 份沙芦草种质的表型性状（表2）变异系数在10.30%～62.91%之间，其中第二颖长的变异系数最小，为10.30%；外稃芒长最大，为62.91%。遗传多样性指数（H′）在1.790～2.080之间，平均遗传多样性指数为1.997，其中穗轴第1节间长的H′最小，为1.790；旗叶长的H′最大，为2.080。分析结果显示，76 份材料具有丰富的表型形态，有利于特异种质的筛选和核心种质的抽提。

表2 不同沙芦草种质材料表型性状基本统计分析

2.2 核心种质构建方案筛选

2.2.1 取样方法的筛选在25%的取样比例中，多次聚类偏离度取样法构建的16 个核心种质方差差异百分率（VD）均大于3.85%，极差符合率（CR）均大于88%，变异系数变化率（VR）均大于114%（表3）。多次聚类随机取样法构建的16 个核心种质方差差异百分率（VD）均小于7.69%，极差符合率（CR）均小于90.85%，变异系数变化率（VR）均小于116.37%。多次聚类优先取样法构建的16 个核心种质效果最差，其参数除极个别外都小于多次聚类偏离度取样法。同时采用同一遗传距离和聚类方法时，多次聚类偏离度取样法构建的核心种质大多具有更高的方差差异百分率（VD）、变异系数变化率（VR）。因此，多次聚类偏离度取样法更适合构建沙芦草核心种质。这与番茄[13]、灰楸[25]、高粱[26]等核心种质构建效果最好的研究结果相吻合。

表3 不同构建策略的比较

2.2.2 遗传距离的筛选根据表3 结果，在多次聚类偏离度取样法下，欧式距离和马氏距离构建的核心种质均值差异百分率（MD）均小于20%，且在欧式距离下的核心种质D-D1C4、D-D1C6、D-D1C7 和马氏距离下的核心种质D-D2C1、D-D2C8 都具有最大的方差差异百分率（VD）19.23%，但核心种质D-D1C6 具有较大的变异系数变化率（VR）121.58%。此外，欧式距离构建的3种核心种质变异系数变化率（VR）在多次聚类随机取样法和多次聚类偏离度取样法下大多数表现为欧式距离大于马氏距离，即S-D1、D-D1 大于S-D2、D-D2。因此，欧式距离略优于马氏距离，更适合构建沙芦草核心种质。这进一步验证了标准化欧氏距离更适于处理含有较多不同类型性状的种质资源群体的观点[12，25-26]。

2.2.3 聚类方法的筛选在欧式距离下，采用多次聚类偏离度取样法时，可变类平均法（C6）和可变法（C7）构建的核心种质具有最大的方差差异百分率（19.23%），其中可变类平均法（C6）拥有较大的变异系数变化率（VR）121.58%，因此可变类平均法略优（表3）。故在25%的取样比例下，“多次聚类偏离度取样法+欧式距离+可变类平均法”是构建沙芦草核心种质的最佳组合。

2.2.4 总体取样比例的确定采用筛选出的最佳核心种质构建策略，即以多次聚类偏离度取样法、欧氏距离和可变类平均法，按照7 个不同的取样比例，即10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%构建7 个初级核心种质子集（表4）。从表中可以看出，7 个核心子集中，核心种质取样比例在10%时，极差符合率（CR）小于80%，不符合Hu 等[21]核心种质构建要求，应予以排除；其他6 个核心种质极差符合率（CR）均大于80%，在取样比例为25%和30%时，其方差差异百分率（VD）最大（19.23%），但取样比例为25%时，其变异系数变化率（VR）更大（121.58%），核心种质能在一定程度上去除原种质的遗传冗余，并且较好地保持原种质的遗传变异。

表4 7 种取样比例构建的核心种质评价参数比较

因此，选择“多次聚类偏离度取样法+欧式距离+可变类平均法+25%的取样比例”的策略构建沙芦草核心种质。

2.3 核心种质评价利用均值、表型方差、极差、变异系数等评价核心种质是否具有代表性（表5）。根据表4 与表5 的结果，在D-D1C6-25%标准下构建的核心种质，其均值差异百分率（MD）为0 且各性状均不存在显著差异；各性状的极差符合率（CR）为91.81%，表明核心种质保留了原始群体中的特殊种质；各性状指标的变异系数变化率（VR）为121.58%，变异系数整体上高于原始群体，表明核心种质具有良好的异质性；各项指标方差差异百分率（VD）为19.23%，小穗宽、垂直株高、旗叶至穗基部长、穗下第1 节间长等4 个性状的方差显著高于原始群体，叶层高度和穗轴第1 节间长的方差极显著高于原始群体，表明核心种质差异可以代表原始群体的变异。

表5 核心种质与原始种质各性状评价参数和t 检验、F 检验

2.4 核心种质验证如表6 所示，利用主成分分析对获得的19 份沙芦草核心种质资源（表7）与原种质资源进行比较分析，二者均有7 个主成分特征值大于1，包含各性状84%以上的遗传多样性信息，并且核心种质累计贡献率比原始种质累计贡献率高，也证明所构建的核心种质资源代表性和可靠性较高。

表6 原种质资源与核心种质资源表型性状主成分比较

表7 19 份沙芦草初级核心种质

3 结论与讨论

种质资源是品种选育的物质基础，优良核心种质的获得是品种培育的芯片。沙芦草在生态防治上起着重要的作用，但是在核心种质构建方面的研究尚无。本研究基于26 个表型性状进行了构建76 份沙芦草初级核心种质的探讨，为今后沙芦草收集和新种质创新提供基础材料和理论依据。

目前最为常用的遗传距离为马氏距离和欧式距离。已有研究表明马氏距离并不适用于小规模核心种质构建[27]。本研究通过对比两种遗传距离，发现欧氏距离更适于构建沙芦草核心种质。这与菠菜[12]、灰楸[25]、切花小菊[28]等植物的研究结果相似。取样方法一直是核心种质研究的重点。目前，基于表型构建核心种质常用的取样方法有多次聚类随机取样法、多次聚类偏离度取样法和多次聚类优先取样法3 种[29-31]。于秀明等[11]研究表明优先取样法是构建野生黄花苜蓿核心种质的最佳取样方法；郑福顺等[13]研究结果表明偏离度取样法是构建番茄核心种质效果最佳的取样方法。本研究在对比3 种取样方法后，最终确定多次聚类偏离度取样法为沙芦草最佳取样方法。

不同的聚类方法将植物分为不同的组，进而影响核心种质的代表性。目前基于表型构建核心种质常用的聚类方法有8 种，分别为最短距离法、最长距离法、中间距离法、重心法、类平均法、可变类平均法、可变法和离差平方和法。彭枫等[12]的研究表明离差平方和法构建效果优于其他7 种；孙永强等[32]研究结果表明，最长距离法对构建西伯利亚杏核心种质效果最佳。在本研究中，比较了8 种聚类方法的构建效果，发现可变类平均法构建沙芦草核心种质效果最好。

主成分分析可以近似地描述样品在几何空间的分布特征，更好反映其遗传结构，更形象地用来比较核心种质和原种质的分布特征[33]。本研究通过比较核心种质和原始种质的主成分结果，发现二者均有7 个主成分特征值大于1，且核心种质累计贡献率比原始种质累计贡献率高，表明核心种质的建立在一定程度上去除了原始种质中的遗传冗余，进一步确认了在25%的取样比例下，采用欧式距离和可变类平均法并结合多次聚类偏离度取样法是沙芦草核心种质的最佳构建策略。

本研究利用26 个表型性状数据对76 份沙芦草核心种质进行构建时，明确了以欧氏距离、可变类平均法和25%的取样规模结合多次聚类偏离度取样是构建沙芦草核心种质的最适方法，以其进行筛选最终得到19 份核心种质，这些核心种质的各项评价参数优良，能够代表原始种质的遗传差异，并且很好地去除原种质的遗传冗余，可以作为后续沙芦草种质资源研究的材料。